黑曲霉2,3-二羟基苯甲酸与邻苯二酚分解代谢途径基因的鉴定与功能分析

《Genome》：Identification and functional analysis of 2,3-dihydroxybenzoic acid and catechol catabolic pathway genes in Aspergillus niger

　　

微生物通过β-酮己二酸途径（β-ketoadipate pathway）分解代谢多种植物来源的芳香族化合物。该途径包含两个分支，分别以原儿茶酸（protocatechuic acid）和邻苯二酚（catechol）为起始底物，两条分支汇聚于β-酮己二酸（β-ketoadipate），随后进一步催化产生三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA cycle）中间产物。该途径的原儿茶酸分支已在真菌中得到表征。本研究对丝状真菌黑曲霉（Aspergillus niger）中β-酮己二酸途径的邻苯二酚分支基因进行了鉴定。研究人员利用比较转录组学（comparative transcriptomics）及与已知功能基因的同源性比对来预测相关基因。通过构建缺失候选基因的敲除突变体，观察其在2,3-二羟基苯甲酸（2,3-dihydroxybenzoic acid, 2,3-DHB）为唯一碳源培养基上的生长表型（2,3-DHB经由邻苯二酚分支被分解代谢），并利用质谱法（mass spectrometry）检测敲除突变体中积累的代谢产物，对上述预测进行了验证。通过上述多策略方法重构该途径，研究人员确认了此前对dhbA、crcA、kstA和kctA分别编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶（2,3-dihydroxybenzoate decarboxylase）、邻苯二酚1,2-双加氧酶（catechol 1,2-dioxygenase）、β-酮己二酸：琥珀酰-CoA转移酶（β-ketoadipate:succinyl-CoA transferase）和β-酮己二酰-CoA硫解酶（β-ketoadipyl-CoA thiolase）的基因功能注释。研究人员进一步将mciA、mliA和kelA分别鉴定为粘康酸环异构酶（muconate cycloisomerase）、粘康酸内酯异构酶（muconolactone isomerase）和β-酮己二酸烯醇内酯酶（β-ketoadipate enol-lactonase）的编码基因。此外，研究人员首次在真菌中鉴定到一个与β-酮己二酸途径相关的转录调控因子。该基因pcaR在2,3-DHB存在时表达上调，敲除该基因后菌株在2,3-DHB上的生长受到抑制。

论文解读

一、研究背景与科学问题

植物产生大量且种类繁多的芳香族化合物，包括地球上第二大丰富的聚合物——木质素（lignin），以及单宁、苯丙素类、黄酮类、酚酸和香豆素等数千种其他芳香族物质。许多细菌和真菌能够分解代谢这些芳香族化合物，这不仅为微生物提供了丰富的碳源和能量来源，还能消除许多芳香族化合物即使在低浓度下也可能具有的毒性效应。这些分解代谢途径赋予微生物在工业上用于将芳香族化合物转化为高价值产物的潜力，尤其是对于木质素衍生的芳香族化合物而言，因为木质纤维素生物质中的木质素组分通常被焚烧用于能源，而只有不到2%被用于生产增值化合物。此外，芳香族分解代谢途径在污染物生物修复方面也具有应用潜力，包括氯代和多环芳烃、氯代联苯、酚类以及某些农药。

在有氧细菌和真菌中，木质素解聚产生多种单环芳香族化合物，这些化合物进一步汇入七条中心分解代谢途径之一，最终转化为三羧酸循环（TCA cycle）中间产物。其中最常用的两种中间产物3,4-二羟基苯甲酸（3,4-DHB，即原儿茶酸）和邻苯二酚分别代表β-酮己二酸途径的两个分支。这两条分支使用大致类似的反应但各自独立的酶系。在细菌中，邻苯二酚分支的catA、catB和catC基因已在多种细菌物种中被鉴定，并与转录调控因子catR聚集在一起。然而在真菌中，尽管两条分支的化合物和酶均已明确，但此前仅3,4-DHB分支的每个酶都有实验支持的基因功能注释，邻苯二酚分支的基因功能注释尚不完整。仅基于序列相似性和基因表达谱来为真菌代谢途径分配基因往往难以定论，因为存在可同时被诱导的旁系同源基因（paralogues），且重组蛋白可能对相关底物表现出重叠的酶活性。因此，需要额外的实验证据来确定代谢途径的基因。此外，邻苯二酚途径中的化合物（如cis,cis-粘康酸和邻苯二酚）在木质素增值利用方面具有重要的市场价值，而黑曲霉（Aspergillus niger）作为最广泛使用的工业细胞工厂之一，能够高效分解代谢多种木质素衍生芳香族化合物，是构建β-酮己二酸途径高价值中间产物工业平台的理想候选菌株。在此之前，全面了解该途径涉及的基因是优化生产的前提条件。

二、研究内容与主要结论

本研究采用多策略联合方法对黑曲霉中β-酮己二酸途径邻苯二酚分支的每个酶进行了基因功能注释。首先基于与细菌或真菌中已表征基因的同源性以及菌株在2,3-DHB上生长后的转录组分析进行预测，随后为候选基因创建敲除突变体，观察其在2,3-DHB上的生长异常和代谢物积累情况。研究确认了此前对dhbA（NRRL3_04385）编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶、crcA（NRRL3_04787）编码邻苯二酚1,2-双加氧酶、kstA（NRRL3_01886）编码β-酮己二酸：琥珀酰-CoA转移酶、kctA（NRRL3_01526）编码β-酮己二酰-CoA硫解酶的基因功能注释，并首次将mciA（NRRL3_10508）、mliA（NRRL3_10507）和kelA（NRRL3_04788）分别鉴定为粘康酸环异构酶、粘康酸内酯异构酶和β-酮己二酸烯醇内酯酶的编码基因。此外，研究首次在真菌中鉴定到β-酮己二酸途径的转录调控因子PcaR（NRRL3_08331），该基因在2,3-DHB上特异性高表达，其缺失导致菌株在2,3-DHB上完全不能生长。这些发现完善了黑曲霉中邻苯二酚分支全途径的基因注释，为利用该途径进行木质素增值转化和工业生物技术应用奠定了遗传基础。

三、关键技术与方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：其一，基于BLASTP同源性搜索，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中已表征的邻苯二酚途径蛋白序列为查询序列，在黑曲霉NRRL3基因组中筛选候选基因。其二，利用Illumina HiSeq 4000平台进行RNA测序（RNA-Seq）转录组分析，比较菌株在以果糖和2,3-DHB为唯一碳源条件下的基因表达差异，RNA-seq数据已提交至Sequence Read Archive（登录号SRP660760），并与此前3,4-DHB条件下的转录组数据（登录号SRP410706）进行比较。其三，采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，以黑曲霉CBS 138852菌株（源自N402，具有pyrG缺陷和ΔkusA缺失）为亲本菌株，通过共转化单链60核苷酸修复模板创建基因敲除突变体。其四，利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术检测突变体在2,3-DHB或色氨酸为唯一碳源的液体培养基中积累的代谢中间产物。其五，利用AlphaFold预测黑曲霉蛋白结构并与细菌直系同源蛋白的晶体结构（来自蛋白质数据银行PDB）进行比对分析。

四、研究结果

候选基因的鉴定：通过同源性搜索和转录组分析，研究人员为七个酶中的五个找到了多个候选基因。RNA-Seq结果显示，每个酶至少有一个候选基因在2,3-DHB条件下高表达且相对果糖条件显著上调。其中NRRL3_04385（dhbA）、NRRL3_10508（mciA）、NRRL3_10507（mliA）和NRRL3_04788（kelA）分别被确定为最可能的候选基因。邻苯二酚1,2-双加氧酶存在两个候选基因NRRL3_04787（crcA）和NRRL3_05330，后者在2,3-DHB上的表达水平更高。此外，在235个含真菌特异性转录因子结构域（Pfam04082）的基因中，NRRL3_08331在2,3-DHB条件下表达最高（561 TPM），且仅在2,3-DHB而非3,4-DHB条件下特异性上调，被命名为pcaR。

突变体生长表型分析：将预测基因逐一敲除后，在含果糖、2,3-DHB或3,4-DHB为唯一碳源的固体培养基上观察生长表型。所有突变体在果糖上均正常生长。ΔdhbA和ΔcrcA突变体在2,3-DHB上的生长受损但程度较轻，推测可能存在旁系同源基因部分补偿。ΔmciA、ΔmliA和ΔkelA突变体在2,3-DHB上生长极差且无法产孢，而在3,4-DHB上不受影响。ΔkstA和ΔkctA突变体在2,3-DHB上生长受损或完全不能生长，与此前在3,4-DHB上的结果一致。ΔpcaR突变体在2,3-DHB上完全不能生长。此外，单独敲除NRRL3_05330不影响2,3-DHB上的生长，ΔcrcA/ΔNRRL3_05330双突变体与单突变体ΔcrcA的生长也无差异，表明NRRL3_05330不参与体内邻苯二酚降解。

代谢物积累分析：利用LC-MS检测各突变体在2,3-DHB（或色氨酸，用于ΔdhbA）为唯一碳源的液体培养基中积累的代谢中间产物。ΔdhbA突变体以色氨酸为碳源时积累2,3-DHB，经MS/MS碎片谱与标准品比对确认。ΔcrcA突变体积累邻苯二酚，浓度远高于亲本菌株。ΔmciA突变体积累cis,cis-粘康酸，积累量约为亲本菌株的20倍。ΔmliA和ΔkelA突变体分别积累具有粘康酸内酯和β-酮己二酸烯醇内酯预期质量的化合物，其保留时间与cis,cis-粘康酸不同，MS/MS碎片谱也彼此不同。ΔkstA突变体在消耗2,3-DHB过程中积累β-酮己二酸，与之前在3,4-DHB上的结果一致。

蛋白质结构比较：利用AlphaFold预测黑曲霉各途径酶的结构并与细菌直系同源蛋白的晶体结构比对。DhbA与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶结构高度相似（RMSD=0.321）。CrcA与红球菌（Rhodococcus opacus）邻苯二酚1,2-双加氧酶结构匹配良好（RMSD=1.423）。KelA与伯克霍尔德氏菌（Burkholderia xenovorans）β-酮己二酸烯醇内酯酶结构高度相似（RMSD=0.847）。然而，MciA和MliA与恶臭假单胞菌对应酶的结构无相似性（RMSD分别为10.136和12.552），支持真菌粘康酸环异构酶和粘康酸内酯异构酶与细菌对应酶趋同进化的假说。

五、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，尽管β-酮己二酸途径涉及的化合物和酶活性数十年前已被阐明，但该途径的遗传学研究主要集中在细菌中。真菌途径在3,4-DHB和邻苯二酚两个分支中都涉及与细菌不同的酶，其中邻苯二酚分支的粘康酸环异构酶在氨基酸序列和反应机制上与细菌对应酶无关。此前对黑曲霉和构巢曲霉中β-酮己二酸途径基因的预测证据强度不一。本研究通过同源性、转录组学、突变分析和代谢物分析相结合的方法，为邻苯二酚分支的每个酶都完成了基因功能注释，并首次鉴定到调控该途径基因表达的转录因子PcaR。ΔdhbA和ΔcrcA突变体残余生长的可能解释包括旁系同源基因的存在或替代途径。尽管NRRL3_05330在2,3-DHB上高表达，但双突变体实验排除了其参与体内邻苯二酚降解的可能性，NRRL3_02644仍可能是部分补偿CrcA功能的候选基因。β-酮己二酸：琥珀酰-CoA转移酶的两个其他候选基因NRRL3_01593和NRRL3_11640在2,3-DHB上均上调，可能解释ΔkstA突变体的残余生长。真菌粘康酸环异构酶和粘康酸内酯异构酶在结构和序列上与细菌对应酶完全不同，属于趋同进化的结果。PcaR的调控机制尚不完全清楚，其自身如何被2,3-DHB上调表达有待进一步研究。

研究结论：本研究利用同源性搜索、转录组分析、基因敲除突变体构建和代谢物积累检测等多策略方法，完整鉴定了黑曲霉中β-酮己二酸途径邻苯二酚分支从2,3-DHB脱羧、邻苯二酚开环、粘康酸环化、内酯异构、烯醇内酯水解到β-酮己二酸转化的全部酶编码基因，并确认了与3,4-DHB分支共享的最后两步酶基因。同时，首次在真菌中鉴定到调控该途径基因表达的转录因子PcaR。真菌与细菌在粘康酸环异构酶和粘康酸内酯异构酶上的结构差异为途径工程提供了多样化的酶学元件，真菌酶可能对2,3-DHB中间产物及其他化合物具有不同的催化特性和效率，为利用这些途径进行生物技术应用提供了新的机遇。