靶向肠道–肿瘤轴：益生菌衍生代谢物通过调控NF-κB、PI3K–Akt和MAPK通路作为结直肠癌辅助治疗策略的多组学与体外研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Targeting the gut–tumor axis: probiotic therapy as an adjunct strategy in colorectal cancer treatment

背景：结直肠癌（CRC）是一种多因素疾病，由宿主遗传、免疫失调、环境因素和肠道微生物群之间的相互作用驱动。肠道–肿瘤轴（gut–tumor axis）通过炎症信号、氧化应激、上皮屏障破坏和免疫失衡调节CRC进展。益生菌衍生代谢物作为生物活性分子，能够恢复宿主–微生物组稳态并调节肿瘤相关通路。目的：采用整合多组学分析和体外验证，评估益生菌代谢物作为CRC辅助治疗剂的作用。方法：应用整合网络药理学（network pharmacology）、转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）、代谢组学（metabolomics）和微生物组分析（microbiome profiling）的系统生物学方法。12种益生菌代谢物产生428个预测靶点，其中162个与CRC相关基因重叠。对CRC细胞系（HCT116、HT-29、Caco-2、SW480）进行处理，并分析活力、凋亡、基因/蛋白表达、细胞因子、代谢物和微生物组成。结果：丁酸钠（sodium butyrate，5 mM）使细胞活力降低35.5–42.3%（p < 0.001），使凋亡从8.6%增加至32.4%，与吲哚-3-乙酸（IAA，100 μM）联合时达到41.2%，提示协同促凋亡效应。RNA测序（RNA-seq）鉴定1,248个差异表达基因（DEGs），其中BAX和CASP3上调（log₂FC +1.8至+2.3），IL6、TNF和NFKB1下调（?1.5至?2.1）。蛋白质组学揭示412个差异表达蛋白，包括AKT1（?1.6倍）、MAPK1（?1.4倍）和EGFR（?1.3倍）下调，以及CASP3（+1.7倍）和BAX（+1.5倍）上调。细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β分别降低48.2%、44.7%和39.5%，而IL-10增加26.3%。代谢组学显示丁酸增加2.8倍，氧化应激降低约35%。微生物组多样性改善（Shannon指数2.8–3.6）。结论：益生菌衍生代谢物调节NF-κB、PI3K–Akt、MAPK和凋亡通路，支持其作为CRC管理辅助治疗剂的潜在作用。

结直肠癌（CRC）仍是全球主要健康负担，是癌症相关发病和死亡的主要原因之一。其发病率增加由遗传易感性、环境暴露、饮食模式和生活方式因素之间的复杂相互作用驱动。尽管手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗取得进展，晚期疾病临床结局仍不理想，迫切需要创新辅助治疗策略。近期证据确立肠道微生物组是结直肠癌发生的中心调节者，肠道微生物生态系统与宿主分子通路动态互作，影响肿瘤起始、进展和治疗反应。肠道菌群失调（dysbiosis）与CRC发展密切相关，并通过慢性炎症、氧化应激、免疫失调和基因毒性代谢物产生促进肿瘤发生。CRC常以致病菌群富集和有益微生物耗竭为特征。微生物代谢物是宿主–微生物组互作的关键介质，短链脂肪酸（SCFAs）尤其丁酸、吲哚衍生物和胆汁酸代谢物调节炎症、表观遗传修饰和细胞代谢。益生菌及其衍生代谢物通过调节炎症信号通路、增强上皮屏障功能、免疫调节和抑制致病微生物活性发挥抗癌作用。高通量技术如转录组学、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学可在系统水平全面表征宿主–微生物组互作，整合多组学数据与网络药理学和计算模型有助于识别CRC进展关键分子通路，包括NF-κB、PI3K–Akt和MAPK信号通路。然而，整合微生物代谢物、宿主信号网络和实验验证的系统级理解仍有限。因此，研究人员开展本研究，旨在通过整合多组学分析、基于网络的通路建模和体外验证，研究益生菌衍生代谢物调节肿瘤相关通路的作用机制。

在方法上，研究人员采用多层整合系统生物学框架，结合网络药理学、多组学数据整合和体外实验验证。代谢物通过文献挖掘和数据库鉴定；靶点使用SwissTargetPrediction、STITCH和BindingDB预测；CRC相关基因来自GeneCards、DisGeNET和OMIM；重叠靶点经STRING和Cytoscape构建蛋白质–蛋白质相互作用（PPI）网络，并用cytoHubba鉴定枢纽基因（hub genes），DAVID和Enrichr进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。实验使用HCT116、HT-29、Caco-2和SW480细胞系，结合CCK-8、Annexin V-FITC/PI流式、RNA-seq、LC–MS/MS蛋白质组、Luminex细胞因子、非靶向代谢组和16S rRNA测序；其中16S rRNA测序的粪便样本来自体外肠道微生物发酵模型。

研究结果：3.1 益生菌衍生代谢物的鉴定：通过数据库挖掘和文献综述，共鉴定12种关键代谢物，包括短链脂肪酸（SCFAs：丁酸、乙酸、丙酸）、吲哚衍生物（吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酸）、乳酸和细菌素；SCFAs分子量低（<150 Da）且生物利用度高。3.2 靶点预测与CRC基因数据集构建：整合数据库预测428个代谢物相关靶点，经相关性评分过滤获得1,236个CRC相关基因，交集分析得到162个潜在治疗靶点。3.3 蛋白质–蛋白质相互作用网络与枢纽基因鉴定：PPI网络包含162个节点和1,984条边，平均节点度24.5；鉴定10个枢纽基因，包括TP53、AKT1、MAPK1、PIK3CA、NFKB1、TNF、IL6、STAT3、BAX和CASP3，聚类系数均>0.65。3.4 功能富集分析：GO富集显著涉及炎症反应、凋亡过程和免疫调节；KEGG通路富集于NF-κB信号、PI3K–Akt信号、MAPK信号和凋亡通路。3.5 益生菌代谢物对细胞活力和凋亡的影响：丁酸钠呈剂量依赖性抑制CRC细胞增殖，5 mM处理48 h使HCT116降低42.3%、HT-29降低38.7%、Caco-2降低35.5%、SW480降低40.1%（p<0.001），估计IC₅₀为4.2–5.6 mM；IAA（100 μM）具中等抗增殖作用；流式显示HCT116总凋亡率由8.6%增至32.4%，联合IAA后达41.2%，提示协同促凋亡效应。3.6 转录组分析（RNA测序）：RNA-seq鉴定1,248个差异表达基因（DEGs），其中652个上调、596个下调；BAX和CASP3上调（log₂FC +1.8至+2.3），IL6、TNF和NFKB1下调（log₂FC ?1.5至?2.1，调整p<0.01）；基因集富集分析（GSEA）证实NF-κB信号抑制和凋亡通路激活。3.7 蛋白质组分析（LC–MS/MS）：定量蛋白质组鉴定3,562个蛋白，其中412个差异表达；AKT1（?1.6倍）、MAPK1（?1.4倍）和EGFR（?1.3倍）下调，CASP3（+1.7倍）和BAX（+1.5倍）上调；通路富集支持PI3K–Akt和MAPK通路抑制。3.8 细胞因子谱分析（多重检测）：多重细胞因子分析显示IL-6降低48.2%、TNF-α降低44.7%、IL-1β降低39.5%（p<0.001），抗炎IL-10增加26.3%。3.9 代谢组学分析：非靶向代谢组鉴定186个显著改变代谢物，SCFA相关代谢通路富集；胞内丁酸增加2.8倍，氧化应激标志物降低约35%，提示细胞氧化还原平衡改善。3.10 微生物组分析（16S rRNA测序）：16S rRNA测序显示Firmicutes由42.3%增至51.7%，Actinobacteriota由6.8%增至11.4%，Proteobacteria由18.5%降至11.2%，Fusobacteriota由7.6%降至4.1%；属水平Lactobacillus和Bifidobacterium分别增加2.4倍和1.9倍，CRC相关Fusobacterium减少约41%；Shannon指数由2.8升至3.6（p<0.001），β多样性显示处理组与对照组分离。3.11 整合多组学分析：整合转录组、蛋白质组和代谢组数据表明枢纽基因和通路受协调调控；网络分析确认益生菌代谢物通过多靶点调节NF-κB、PI3K–Akt、MAPK和凋亡通路；丁酸抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）与肿瘤抑制基因表达增加和炎症信号降低相关。

讨论部分总结：该研究提供肠道–癌症轴的系统级理解，表明益生菌衍生代谢物通过协调调节炎症信号、凋亡、免疫反应和代谢通路，在CRC中发挥多靶点抗癌作用。枢纽基因TP53、AKT1、MAPK1、PIK3CA和NFKB1是肿瘤增殖、存活和炎症信号的中心。AKT1、MAPK1和NFKB1下调，以及BAX和CASP3上调，提示肿瘤生长抑制和凋亡激活。丁酸作为HDAC抑制剂，促进肿瘤抑制通路的表观遗传激活并抑制NF-κB等促炎信号。吲哚衍生物通过降低促炎细胞因子表达和增强抗炎反应参与免疫调节。微生物组分析显示有益菌群增加和致病菌减少，提示肠道微生物稳态恢复。体外验证在多个CRC细胞系中确认细胞活力降低和凋亡增加，联合代谢物处理效应增强。讨论也指出局限性：研究主要使用体外CRC细胞模型，缺乏临床患者样本验证；缺乏体内实验；微生物组组成、代谢物产生、饮食因素和肿瘤异质性等个体间差异未纳入；详细剂量–反应曲线和IC₅₀分析未包括，未来需动物模型和临床队列验证。

研究结论翻译：本研究显示，益生菌衍生代谢物通过调节CRC中多靶点炎症、凋亡和免疫信号通路来调节肠道–肿瘤轴。将多组学分析与体外验证整合，强调NF-κB、PI3K–Akt和MAPK等关键通路在介导这些效应中的作用。这些发现支持益生菌衍生代谢物作为辅助治疗剂的潜力，并为开发微生物组信息化的CRC管理策略提供基于系统的框架。