AR平台：人工智能（AI）驱动的增强双荧光报告系统用于基因编辑效率自动化评估与智能解读

《Animal Research and One Health》：AR: An Artificial Intelligence-Driven Fluorescent Reporter System for Gene Editing Evaluation

　　

对基因编辑效率进行准确且可扩展的评估，对于新型编辑工具的开发至关重要。然而，传统方法费时、昂贵且通量低。在此，研究人员开发了人工智能（AI）驱动的荧光报告（AR）平台，这是一种整合系统，可自动化并简化整个评估工作流程。AR平台将增强型荧光报告系统与AI驱动的分析流程相结合。该双荧光报告系统中，携带PEST结构域的mCherry（红色荧光蛋白）与GFP（绿色荧光蛋白）配对，可支持具有不同PAM（原间隔子邻近基序）需求的Cas变体，并将编辑效率量化为仅表达GFP（GFP⁺）细胞的比例。该平台的AI模块EasyReporter将用于自动细胞分割和定量的深度学习模型与基于大语言模型（LLM）的智能体相整合，用于智能数据解读和综合报告生成。由AR测得的编辑效率与流式细胞术（flow cytometry）测得的编辑效率（Spearman ρ = 0.77）以及扩增子测序（amplicon sequencing）测得的编辑效率（Spearman ρ = 0.83）相关。AR平台提供高通量、自动化的工作流程，可加速基因编辑研究。未来，它将特别有效地量化大片段基因编辑的效率，为AI赋能的生物实验室提供新框架。

研究背景与问题：自2012年CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）基因编辑出现以来，编辑工具箱已扩展至Cas变体、非Cas RNA引导核酸酶TnpB和IscB、碱基编辑器（base editors）和先导编辑器（prime editors）。编辑工具扩展推动了对准确、高通量评估编辑效率的需求。可靠定量可支持从宏基因组数据集中挖掘候选编辑器的功能筛选，并为工程化蛋白变体的理性设计和迭代优化提供信息。基因编辑工作流常需筛选大量引导RNA（gRNA）或蛋白变体。传统效率量化方法包括T7核酸内切酶I测定（T7 endonuclease I assay）、聚合酶链反应–限制性片段长度多态性分析（PCR–RFLP）、Sanger测序和扩增子测序（amplicon sequencing）。这些方法需裂解细胞并提取DNA，限制实时监测并增加高通量筛选工作量。荧光报告系统可通过批量样本分析降低筛选时间和操作成本，但许多报告系统依赖特定PAM（原间隔子邻近基序），限制可评估的编辑器和靶位点；定制报告设计和依赖流式细胞仪等仪器也限制快速、高通量筛选。荧光报告系统计算编辑效率需在荧光图像中定量阳性细胞，人工识别与计数耗时且主观，限制分析规模。AI（人工智能）驱动图像分析，包括U-Net变体、Mask R-CNN和Cellpose，可自动细胞分割，并在高内涵筛选、组织病理学和活细胞追踪中显示价值。整合AI分析流程可提高通量并改善基于荧光的基因编辑评估可重复性，从人工主观评分转向可扩展客观测量。LLM（大语言模型）具备上下文理解、数据推理和知识整合能力，已进入基因编辑领域，如CRISPR-GPT支持gRNA设计和工作流开发。但基因编辑实验产生跨多个编辑系统、靶点和生物背景的异质数据，解读需结合大量先前生物学知识。LLM可总结此类数据、识别跨研究模式并联系已有知识。传统分析难以规模化提供这种整合。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员开发并验证AR平台，将增强双荧光报告系统、自动图像分析和LLM辅助报告生成耦合，将荧光图像转为结构化、可解释报告，简化基因编辑评估。结论是AR平台提供高通量、自动化工作流，加速基因编辑研究；未来将特别有效量化大片段基因编辑效率，为AI赋能生物实验室提供新框架。其意义在于提高实验效率，并为基因编辑结果和工具性能提供全面见解，支持基因编辑工具开发和优化。

关键技术方法（不超过250字）：本研究以HEK293T（人胚肾293T）细胞为样本来源，未涉及临床队列。研究人员构建RGFP和RGFP-PEST稳定报告细胞系，采用SpCas9（酿脓链球菌Cas9）和hfCas12Max（高保真Cas12Max）进行编辑；以荧光显微成像、流式细胞术（flow cytometry）和靶向扩增子测序（amplicon sequencing）进行多模态定量。EasyReporter基于Cellpose进行自动细胞分割，通过跨通道质心匹配分类GFP⁺和mCherry⁺细胞，并使用DeepSeek大语言模型（LLM）生成结构化报告。

研究结果：

增强荧光报告系统的设计与表征：研究人员开发RGFP和增强版RGFP-PEST。RGFP为mCherry（红色荧光蛋白）和GFP（绿色荧光蛋白）组合。mCherry翻译起始位点位于靶区域和mCherry编码序列之间，下游于编辑靶点，防止单侧编辑导致mCherry开放阅读框移码，保持荧光读出准确性。RGFP-PEST含融合至mCherry C端的PEST序列（富含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸的降解信号）促进蛋白降解。通过慢病毒转导和流式分选建立稳定共表达GFP和mCherry的HEK293T细胞系。未编辑细胞为mCherry⁺和GFP⁺双阳性；配对sgRNA（单链引导RNA）靶向mCherry两侧，删除其编码序列；编辑细胞失去mCherry信号，仅GFP⁺。编辑效率计算为GFP⁺单阳性细胞占GFP⁺单阳性和双阳性细胞总和的比例。靶区域容纳不同PAM，包括SpCas9的NGG和hfCas12Max的TTN，共含19个NGG和23个TTN位点。流式细胞术分析显示，SpCas9和hfCas12Max系统中RGFP-PEST测得编辑效率较RGFP显著增加，表明RGFP-PEST敏感性更优。

EasyReporter：用于自动定量和智能解读的AI平台：为克服流式细胞术通量限制和劳动密集，研究人员开发EasyReporter，基于图像策略高通量处理荧光显微图像，以量化基因编辑效率。其分析模块用深度学习Cellpose算法分割细胞，提取轮廓、坐标和荧光强度；支持计数mCherry⁺或GFP⁺细胞并计算编辑效率。基于DeepSeek的报告模块总结定量输出并提供实验优化建议。报告和图可以PNG和PDF等格式下载。EasyReporter提供Linux和Windows网页界面，支持拖拽上传；提供七种用户可配置可视化：细胞坐标图、象限分布图、模拟流式图、编辑效率条形图和箱线图、Spearman和Pearson相关图。AI报告模块解释每种可视化，提供数据摘要、统计见解和实验优化建议。

EasyReporter在RGFP-PEST系统中研究基因编辑事件的应用：研究人员用SpCas9和hfCas12Max各三个靶点进行CRISPR编辑，并行用荧光显微EasyReporter、流式和扩增子测序量化。EasyReporter多层分析：从显微图像提取空间坐标和荧光状态重建原位细胞分布；按荧光信号分类生成象限分布图；量化单细胞荧光强度生成模拟流式图。利用获取的荧光图像，EasyReporter计算每个显微视野编辑效率，并汇总每个靶点平均效率。SpCas9三个位点效率为20.99 ± 0.63%、20.62 ± 1.26%、12.69 ± 1.64%；hfCas12Max三个位点为8.24 ± 1.35%、11.25 ± 1.73%、22.26 ± 1.36%。DeepSeek报告模块评估多个图像质量指标，包括细胞数、荧光簇离散度、GFP:mCherry信号分离和背景信号；报告的中位细胞数约3906；hfCas12Max的变异系数为0.18–0.29；高编辑效率与更均匀GFP信号（较低变异系数）相关。结论：该多层定量流程在视野和靶点水平总结编辑效率并提供质量背景。

增强荧光报告系统实现的多模态基因编辑效率定量：同一细胞群进一步用流式细胞术和扩增子测序。流式细胞术得SpCas9三个靶点效率22.5 ± 1.23%、17.50 ± 0.66%、12.87 ± 0.55%；hfCas12Max为8.74 ± 0.47%、8.51 ± 0.43%、21.57 ± 0.40%。为区分单侧和双侧编辑事件，测序读段分为未编辑、仅左翼编辑（NL-only）、仅右翼编辑（NR-only）和双翼编辑（NLR）。共编辑评分（coediting score）量化所有编辑读段中同时双翼编辑比例。DNA水平编辑效率：SpCas9为15.92 ± 4.09%、14.22 ± 1.28%、11.20 ± 2.04%；hfCas12Max为6.70 ± 0.60%、7.17 ± 1.68%、26.13 ± 7.56%。扩增子测序鉴定出约750 bp删除，涵盖mCherry编码序列，与报告设计一致。最频繁插入/缺失（indel）变体均涵盖mCherry编码序列。单侧编辑虽可在DNA水平检测，但不产生mCherry切除所需大片段删除，因此不引起功能性荧光表型变化。结果表明测得编辑效率特异反映双翼编辑事件，验证报告系统设计原则。

AR平台对基因编辑的高准确度评估：为基准测试，研究人员将AR测量与流式细胞术（细胞水平）和扩增子测序（分子水平）比较。AR测量与流式细胞术强相关（Spearman ρ=0.77），与扩增子测序强相关（Spearman ρ=0.83），与两种已有方法间相关（Spearman ρ=0.83）相当。同一数据集Pearson相关矩阵相应比较r值分别为0.78、0.93和0.75。18个测量来自六个实验条件，包括三个SpCas9靶点和三个hfCas12Max靶点，每个条件三个生物学重复。结论：AR平台是评估基因编辑效率的可靠定量方法，并具潜力作为简化的基于显微技术的传统技术替代。

讨论部分总结：

关键发现总结：准确评估基因编辑效率是重要步骤；编辑工具、gRNA和递送策略增长需要高效评价方法；AR平台将荧光报告、自动图像分析和LLM辅助解读整合在单一工作流。

RGFP-PEST报告系统：通过将多个PAM序列纳入靶区域，克服传统单PAM报告系统限制，适应不同PAM偏好编辑蛋白，减少为每种兼容编辑器构建单独报告质粒的需要，提高筛选通量、降低成本。双翼靶向策略产生类似自然结构变异的大片段删除，可评估大片段删除效率。目前仅HEK293T细胞，需在其他细胞类型和物种背景进一步验证。PEST是成熟蛋白降解信号，融合到mCherry C端促进降解；成功切除mCherry编码序列后残余mCherry蛋白池耗竭，产生更明显双阳性到GFP单阳性转变；快速mCherry清除可能解释RGFP-PEST较RGFP更高的表观编辑效率。

EasyReporter AI平台：利用验证的Cellpose算法分割细胞并整合自动流程，简化原始图像分析到最终编辑效率计算。与流式和扩增子测序的相关性支持AR用于比较编辑工具评估；这些方法量化荧光定义细胞群或DNA序列变化，未作为绝对参照；相关性表明条件间类似编辑效率趋势。流式和扩增子测序需样品处理，可能偏倚：细胞解离和洗涤导致细胞丢失，PCR引入扩增偏差；图像法原位分析，无解离或扩增，减少细胞丢失和扩增偏差。通量上，AR平台在1小时内完成18个样本图像采集和自动分析，流式需约4–5小时，扩增子测序需数天；与自动多孔成像系统整合可进一步提高通量。LLM平台支持从数据定量转向知识发现；不同于ImageJ主要定量，本平台自动生成含编辑效率等关键参数详细报告，并提供生物学背景解释；通过跨图像比较分析识别跨实验条件模式，提供探索编辑序列偏好机会；简化通常需大量人类专业知识的数据解读，提高通量和可重复性。

局限与未来方向：增加每个样本显微视野数和生物学重复可减少采样方差；保证图像采集时细胞充分分散并保持图像质量可提高AI流程细胞分割准确性。局限：靶区域长度受限限制PAM序列多样性，可能妨碍评估具特定PAM偏好编辑器；报告激活依赖两侧靶点同时编辑，计算编辑效率反映sgRNA诱导大片段删除频率，本质比单基因组位点切割更严格，反映平台设计原则而非直接估计单位点编辑性能；平台更适合筛选有效介导大片段删除的编辑器，解释为精确编辑效率需谨慎。当前AR平台设计用于大片段删除事件（约750 bp），不适用于碱基编辑器或常规先导编辑器；适配这些编辑器是未来方向。

研究结论部分翻译：AR平台将新型报告系统、自动化分析流程和智能解读模块整合为高效、标准化的基因编辑工具评估框架。该框架提高实验效率，并为基因编辑结果和工具性能提供全面见解，从而支持基因编辑工具的开发和优化。