《The Veterinary Journal》：Osteogenic priming of canine perivascular mesenchymal stromal cells enhances extracellular vesicle yield and in vitro activity for bone regeneration
编辑推荐：
•脐带是一个易于获取的非侵入性间充质干细胞（MSC）来源。•成骨预处理可将犬MSC来源的细胞外囊泡（EV）产量提高1.5倍。•经预处理的EV显著增强了受体的细胞迁移能力（体外实验）。•无论是原型EV还是预处理过的EV都能促进犬细胞的矿化过程。•EV携带关键的成骨microRNA（
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脐带是一个易于获取的非侵入性间充质干细胞（MSC）来源。
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成骨预处理可将犬MSC来源的细胞外囊泡（EV）产量提高1.5倍。
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经预处理的EV显著增强了受体的细胞迁移能力（体外实验）。
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无论是原型EV还是预处理过的EV都能促进犬细胞的矿化过程。
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EV携带关键的成骨microRNA（cfa-miR-21、26a、27a和29a）。
引言
在骨科领域，当局部和系统因素（如骨折类型、血液供应、感染、年龄、营养和系统性疾病）干扰骨再生过程时，骨再生可能成为一个重大挑战（Niikura等人，2014年）。恢复受损骨缺损所需的时间和资源相当可观（Hak等人，2014年）。目前有多种方法可以尝试实现最快和最有效的恢复，例如骨移植和成骨牵张术，但这些技术仍然存在相关并发症，导致功能重建出现显著延迟（Roddy等人，2018年）。
在这种情况下，再生医学和组织工程成为研究的重点。间充质基质细胞（MSC）已被用于组织再生研究，有大量证据表明它们主要通过旁分泌作用刺激靶组织中的驻留细胞来促进骨再生（Probst等人，2020年；Lyu等人，2021年）。细胞外囊泡（EV）作为一种无细胞疗法的选择，因其对细胞通信的重要性而受到关注（Théry等人，2018年；Malekpour等人，2022年；Williams等人，2024年）。这些脂质包裹的纳米颗粒由所有细胞类型分泌，在生理和病理状态下都扮演着重要角色，因为它们能传递脂质、蛋白质和核酸等物质（Raposo和Stahl，2019年）。逐渐地，研究开始探索MSC来源的EV的效应，并描述了它们在不同疾病模型中的益处（Heris等人，2022年；Malekpour等人，2022年；Yang等人，2024年）。
尽管研究表明MSC来源的EV对骨再生有益，但体外微环境对这些EV的影响仍在评估中（Hertel等人，2022年）。MSC的效应直接受宿主微环境的影响，通过与损伤/疾病部位的相互作用，具体响应该组织的需求（Sarugaser等人，2009年；Todeschi等人，2015年；Zayed等人，2016年；Carbonare等人，2025年）。由于体外微环境与损伤部位的不同，预期衍生出的EV可能会产生不同的效应。为了提高MSC及其衍生EV的治疗潜力，人们采取了通过改变其微环境来调控这些细胞的方法。这些方法包括改变培养条件、添加可溶性因子、调整维度（2D vs. 3D）、组织工程以及基因修饰（Park等人，2019年；Lee和Kang，2020年）。在骨再生领域，已有多种方法被证明能够增强EV的治疗潜力（Hertel等人，2022年），尽管结果因细胞来源、培养条件、培养基补充物等因素而异。因此，我们研究了所提出的成骨预处理方法是否会影响犬脐带血管周围间充质基质细胞（cPMSC）产生的EV及其骨再生潜力。值得注意的是，来自不同来源的MSC（尤其是骨髓、脂肪组织和脐带）具有不同的再生潜力，因此我们的报告重点关注脐带中的血管周围基质细胞。这一来源具有许多优势，包括易获取性——因为它来自出生时废弃的组织——以及高产量和增殖能力（Sarugaser等人，2009年；Yannarelli等人，2013年；Webb，2016年；Hori等人，2024年）；这些对于大规模生产至关重要。
章节片段
细胞培养、预处理和EV分离
犬脐带血管周围间充质基质细胞（cPMSC）是从维索萨联邦大学（Universidade Federal de Vi?osa）兽医医院进行的治疗性剖宫产术中收集的脐带中分离得到的。所有操作均遵循ARRIVE指南。在收集脐带之前，已获得雌性犬主人的知情同意，该同意得到了机构动物使用伦理委员会的批准（协议编号#07/2022）。
细胞分离、表征和体外实验
cPMSC来源的细胞外囊泡的表征
使用NTA分析，CTRL-EVs和OSTEO-EVs的粒子大小分别为179.9±18.7纳米和111.9±26.5纳米。通过NTA还评估了EV的浓度，结果显示OSTEO-EVs的粒子浓度大约是CTRL-EVs的1.5倍（5.6±0.5×10^10粒子/mL vs 3.7±0.7×10^10粒子/mL）（图1A和1B）。TEM分析显示，OSTEO-EVs和CTRL-EVs均呈现圆形形态（图1C）。EV相关蛋白TSG101的存在也得到了证实
讨论
越来越多的证据表明，间充质基质细胞（MSC）作为干细胞生态位再生的核心调节器发挥作用——主要是通过分泌生物活性分子（Caplan，2009年；da Silva Meirelles等人，2009年）——这使得再生医学研究越来越关注它们的分泌组。使用MSC观察到的所有益处，包括抗凋亡、免疫调节、抗纤维化、促血管生成和趋化作用（da Silva Meirelles等人，2009年；Sarugaser等人，2009年）
结论
通过超速离心成功分离出了细胞外囊泡（EV），其中经成骨预处理的犬脐带血管周围间充质基质细胞（cPMSC）的回收率高于原型细胞。功能测试表明，无论是预处理过的EV还是原型EV都促进了矿化过程，而来自预处理过的MSC的EV还特别增强了细胞迁移能力。此外，成骨微环境丰富了miR-26a、miR-21、miR-29a等microRNA的表达
CRediT作者贡献声明
Fernanda Campos Hertel：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念化。Aline Silvestrini da Silva：方法学、研究、数据分析。Natalia Barone Spachi：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念化。Livia Marina Alvarenga Martins：撰写——审核与编辑、方法学。Carolina Camargos Rocha：撰写——审核与编辑、方法学。Silvia Cristina Verde Mendes
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了维索萨联邦大学动物使用伦理委员会（Comiss?o de ética no Uso de Animais - CEUA UFV）的批准（批准编号07/2022）。
撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本研究时，作者使用了Google的Gemini工具进行语法校正和英语语言改进。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审核和编辑，并对发表文章的内容负全责。
作者声明没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢FAPEMIG（APQ-00487–22和APQ-02486–22）、CAPES（财务代码001）、CNPq（305782/2024–0、315750/2023–5）、显微镜与显微分析中心 – UFV、BIOAGRO – UFV、兽医院 – UFV以及机构实验室，以及LINBIO – UFMG在生物标志物研究方面的支持。
Fernanda Campos Hertel|Aline Silvestrini da Silva|Natalia Barone Spachi|Livia Marina Alvarenga Martins|Carolina Camargos Rocha|Silvia Cristina Verde Mendes Nolasco|Laura do Amaral Xavier|Juliana de Oliveira Silva|André Luis Branco de Barros|José Domingos Guimar?es|Adriano de Paula Sabino|Emily Correna Carlo Reis
