《Virology》：Influenza Viruses as Vaccine Vectors: Historical Background and Future Directions
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摘要流感病毒作为实验性疫苗载体已有三十多年历史，兼具黏膜递送、分节段反向遗传学和临床验证的减毒策略等优势。本综述总结了基于甲型和乙型流感病毒的载体设计历史见解，并提出该平台未来的应用方向。特别地，我们建议使用三价减毒活流感疫苗（LAIV）作为可重复使用的季节性多载体系统。在此
摘要
流感病毒作为实验性疫苗载体已有三十多年历史，兼具黏膜递送、分节段反向遗传学和临床验证的减毒策略等优势。本综述总结了基于甲型和乙型流感病毒的载体设计历史见解，并提出该平台未来的应用方向。特别地，我们建议使用三价减毒活流感疫苗（LAIV）作为可重复使用的季节性多载体系统。在此方法中，A/H1N1、A/H3N2和流感B疫苗毒株可各自携带来自多种人类呼吸道病毒的不同外源抗原盒。年度毒株替换作为流感疫苗接种的固有特征，将同时提供对选定非流感病原体的重复黏膜加强免疫。对于甲型流感病毒，已积累了大量关于携带来源于其他病毒或细菌的异源抗原盒嵌合构建体设计的知识。广泛的动物研究和临床试验已证实该平台的可行性，并凸显了减毒甲型流感病毒作为靶抗原递送载体的巨大潜力，其能够激发强烈的免疫反应。相比之下，基于乙型流感病毒的载体数据仍然稀少且零散。然而，鉴于三价LAIV中的乙型流感毒株是免疫反应的强力诱导剂，该载体平台的进一步发展不仅可以克服流感基因组对外源插入片段的包装限制，还能有效创建针对流行病学最相关呼吸道病原体的多价疫苗。
引言
流感病毒已成为有前景的病毒载体，用于将来自致病病毒或细菌的免疫原性抗原递送至靶细胞，以激发针对插入转基因的集中免疫反应[1]。该平台相比其他递送系统具有显著优势，这归因于几个关键特征。因此，减毒活流感疫苗（LAIV）已在数十年的时间内安全地应用于大规模且人口统计学多样化的人群，其安全性、免疫原性和保护效力已得到充分确立[2]。这些活疫苗通过鼻喷雾剂进行鼻内给药，这是一种无痛、无针的程序，比肌内注射更易被儿童群体广泛接种所接受；此外，该途径允许在非临床环境中自行给药[3]，因为它消除了对训练有素的人员进行注射的需求。此外，流感载体平台固有的支持对流行的季节性流感病毒产生持续的保护性免疫——这是最重要的呼吸道病原体之一。这些疫苗毒株根据世界卫生组织的年度建议定期更新，鼻内免疫诱导针对流感病毒抗原的所有适应性免疫反应分支[4]。此外，现已积累大量证据表明，使用当代反向遗传学方法可以容易地产生嵌合流感病毒，并且已确定了将外源抗原插入病毒基因组以最大化免疫原性的最有前景的策略[5]。
本综述从两个互补的角度考察流感病毒作为疫苗载体：历史视角和前瞻视角。从历史上看，甲型流感病毒（IAV）载体已被广泛用于设计针对病毒和细菌抗原的疫苗，而乙型流感病毒（IBV）载体更新且发展较少，但正在作为一种新的递送载体兴起[6,7,8,9,10,11,12]。展望未来，季节性LAIV制剂本身可以被重新构想为可再生的多载体平台。三价LAIV含有三种疫苗毒株，经典的A/H1N1、A/H3N2和一个流感B谱系组分，原则上每种毒株都可以被工程化以递送不同的外源抗原盒。
我们的核心思想超越简单的抗原递送：我们提出，流感疫苗接种的年度运动可以被利用为无关病原体的内置加强免疫时间表。随着流感疫苗毒株根据WHO建议定期更新，基于载体的三价LAIV可以同时更新流感保护和针对其他病原体的免疫力。然而，这一概念需要谨慎对待：对于每种毒株-插入物组合，插入物的稳定性、遗传相容性、减毒特性、生产产量和安全性都必须得到证实。尽管如此，这种方法将年度毒株替换过程从一个后勤挑战转化为一个功能性平台。
章节摘要
历史视角：甲型流感载体
流感A病毒成为流感病毒载体领域的主导平台，很大程度上归功于使遗传操纵成为可能的早期技术突破。决定性的里程碑是20世纪90年代末质粒基反向遗传学（RG）系统的发展，由Neumann等人（1999）和Fodor等人（1999）独立报道，允许完全从克隆的cDNA挽救出感染性流感病毒[13,14]。这些进展与RG技术的可用性相结合……
历史视角：乙型流感载体
基于IBV的载体发展落后于甲型流感病毒，且一直相对有限；然而，一系列独立研究现已确立IBV能够支持外源基因插入和抗原递送。使用B/Lee/40骨架的早期反向遗传学研究表明，修饰后的NA片段可以容纳GFP，为IBV基因组工程提供了原理验证，尽管这是在研究BM2必需性而非疫苗设计的背景下进行的[23]。
流感载体疫苗免疫原性片段的筛选
流感载体发展的历史显示了两条部分重叠的轨迹：一条以抗体诱导的结构抗原为中心，另一条侧重于保守的T细胞表位。后者与流感载体生物学更加兼容，因为短表位更容易插入，对病毒适应性的破坏更小，并且更可能通过内源性抗原呈递途径进行加工。相比之下，设计用于诱导抗体的结构抗原往往……
三价LAIV作为可再生的多载体平台
推进上述方法的一个有前景的方向是重新构想LAIV毒株——不是作为重组疫苗设计的个体载体，而是作为三价制剂中三个协调的黏膜病毒载体的集成系统。在此构型中，A/H1N1、A/H3N2和流感B组分可以被工程化以递送不同的异源抗原盒。例如，一种毒株可能编码源自呼吸道合胞病毒（RSV）的T细胞表位……
季节性毒株更新作为重复异源抗原加强免疫的机会
由于季节性流感病毒持续经历抗原进化，疫苗毒株必须定期更新——这是常规流感疫苗接种的一项重要运营要求。然而，对于载体LAIV平台而言，这种反复的配方更新可以成为重复加强预定异源抗原的机会，前提是外源盒与每种更新的骨架保持兼容，并且反复给药被证明是安全的，且……
流感病毒载体在其他疫苗平台背景下的定位
流感病毒载体占据了一个独特的生态位，而非其他平台的普遍替代品。它们的主要差异化特征是鼻内、复制依赖性抗原递送的可能性，且在一个已经包括流感毒株替换的季节性疫苗框架中。相反，它们相对有限的插入耐受性和对LAIV兼容人群的依赖性，要求根据转基因大小、期望的免疫……来选择平台。
流感病毒载体的局限性
流感病毒载体的主要局限性源于其对减毒活、复制能力骨架的依赖。LAIV的使用具有人群和适应症特异性，而大多数季节性流感疫苗接种计划依赖于灭活、裂解病毒、重组或其他非复制性产品。因此，复制依赖性流感载体策略不能假定为可以直接推广到所有年龄段、临床环境或国家免疫规划中。在……
安全性、制造和监管考虑
联合三价疫苗的安全性必须在每种遗传骨架、每种插入盒以及最终制剂整体的层面上进行评估。LAIV的减毒通常是多基因和表型性的，由主供体病毒的冷适应性和温度敏感性驱动。对于甲型和乙型供体，与减毒相关的关键突变位于聚合酶复合物基因中，这些基因不受用于……的遗传操作影响。
未来展望
近期的未来应侧重于合理的平台基准测试。因此，表达相同抗原的匹配IAV和IBV载体应直接进行比较。此外，应设计三价制剂，其中一种、两种或所有三种毒株携带外源插入物，以便测量毒株干扰和抗原表达平衡。最后，年度更新模拟应测试反复季节性给药是否能在不影响流感疫苗效力或安全性的情况下加强非流感反应……
结论
流感病毒是经过历史验证但仍被低估的疫苗载体支架。IAV载体提供了最广泛的证据基础，涵盖病毒和细菌抗原。IBV载体仍处于较早阶段，但提供了具有有用包装和重排特性的互补支架。下一个概念步骤是将三价LAIV作为可再生的多载体平台：A/H1N1、A/H3N2和B毒株可以各自递送外源抗原，同时仍作为流感疫苗发挥作用。……
CRediT作者贡献声明
Victoria Matyushenko：写作——审阅与编辑，可视化，软件，概念化。Larisa Rudenko：写作——审阅与编辑，监督，资源，资金获取。Irina Isakova-Sivak：写作——初稿，项目管理，概念化。
资助
本综述在俄罗斯科学基金会（RSCF）赠款№25-15-00240的财政支持下完成。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：
Larisa Rudenko报告获得俄罗斯科学基金会的财务支持。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。
Irina Isakova-Sivak | Victoria Matyushenko | Larisa Rudenko
俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所
