薄荷精油（Mentha piperita L.）化学组成及其与(R)-(+)-limonene相比的抗菌、抗生物膜和杀虫活性研究

《Journal of the Science of Food and Agriculture》：Unveiling chemical composition of peppermint oil and its bioactivities compared with (R)-(+)-limonene: antimicrobial, antibiofilm, and insecticidal perspectives

　　

背景：薄荷（Mentha piperita L.）精油（MPEO，peppermint essential oil）因其广谱抗菌特性及在食品保鲜中的潜在应用而受到认可。本研究旨在确定MPEO的生物活性是否归因于(R)-(+)-limonene，或者完整精油是否因多种成分间相互作用而提供更高功效。结果：研究人员采用气相色谱-质谱联用（GC–MS，gas chromatography–mass spectrometry）对MPEO进行表征，并在体外评估其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母的抗菌活性，以及在草莓、李子、甜菜根和番茄上以气相进行原位评估。针对肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）的抗生物膜活性通过结晶紫试验和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS，matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）评估，同时测试其对Callosobruchus maculatus和Megabruchidius dorsalis的杀虫活性。GC–MS显示为薄荷醇化学型，以薄荷醇（54.2%）为主，并含有异薄荷酮（8.4%）、异薄荷醇乙酸酯（5.7%）、1,8-桉叶素（5.7%）、芳樟醇（3.1%）、β-石竹烯（3.5%）、柠檬烯（2.7%）和α-蒎烯（1.5%）。MPEO通常比(R)-(+)-limonene产生更大的抑制圈和更低的最小抑制浓度（MIC，minimum inhibitory concentration）值，并具有更强的原位生长抑制。两种试验均证明具有抗生物膜活性。在杀虫试验中，柠檬烯在6.25–50%时比MPEO更有效，而在100%时两种处理几乎完全有效。结论：MPEO显示出比(R)-(+)-limonene更强的总体抗菌功效，支持其成分间相互作用的重要性。其联合抗菌、抗生物膜和杀虫活性表明其可作为天然生物保鲜剂及在有害生物综合治理中应用。? 2026 作者。Journal of the Science of Food and Agriculture 由 John Wiley & Sons Ltd 代表 Society of Chemical Industry 出版。

植物精油是挥发性次生代谢物的复杂混合物，主要由单萜和倍半萜组成，其生物活性来自多种化合物的协同作用。近年来，精油因其抗菌、抗生物膜和杀虫特性而成为合成防腐剂和农药的天然替代物，受到食品保鲜和作物保护领域关注。薄荷（Mentha piperita L.）精油（MPEO，peppermint essential oil）以薄荷醇和薄荷酮为主，并含乙酸薄荷酯、1,8-桉叶素和柠檬烯等。其抗菌作用已有广泛报道，涉及革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和念珠菌属酵母。生物膜形成是食品安全的重要挑战，固着微生物群落对消毒剂和环境胁迫耐受性增强。薄荷油可干扰肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）生物膜发育，并影响白色念珠菌黏附和菌丝转变。(R)-(+)-limonene是天然丰富的单环单萜，也具有抗菌、抗真菌和抗生物膜作用。精油和单萜的杀虫潜力亦受关注，薄荷油在熏蒸和触杀试验中有效，(R)-(+)-limonene对多种鞘翅目和鳞翅目害虫有毒，并已证实对入侵性种子甲虫Megabruchidius dorsalis和豇豆象Callosobruchus maculatus具有熏蒸毒性。尽管已有许多单独研究描述薄荷油和柠檬烯的抗菌、抗生物膜和杀虫作用，但少有工作在相同实验框架内跨体外和原位条件直接比较二者。尤其气相发挥关键作用的果蔬原位评价仍不足。研究人员因此旨在确定MPEO生物活性是否与其中一个单萜(R)-(+)-limonene有关，还是完整精油因多种成分协同而更有效。研究人员假设MPEO因多成分联合作用而比分离的(R)-(+)-limonene表现出更广和更强的抗菌及抗生物膜活性。为此，两种处理均通过互补生物学指标评价：抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母，干扰S. enterica生物膜发育，对两种仓储害虫的杀虫活性，以及在果蔬上的原位试验。该工作的新颖性在于整合设计，首次结合抗菌、抗生物膜、杀虫和食品保鲜试验，直接比较复杂精油与其成分，从而为天然生物活性中的协同作用提供新见解。此外，在此规模上对上述商品使用挥发性柠檬烯进行原位抗菌测试，以及使用MALDI-TOF MS Biotyper分析监测生物膜形成及其改变，也代表新方法。

关键技术与方法方面，研究人员采用GC–MS分析MPEO化学组成；从捷克微生物保藏中心（CCM，Czech Collection of Microorganisms）获取细菌和酵母参考菌株，并使用从生牛奶样品中分离、经测序鉴定的产膜S. enterica；采用圆盘扩散法和肉汤微量稀释法测定抗菌活性及MIC₅₀和MIC₉₀；在草莓、李子、甜菜根和番茄上进行气相原位抗菌评价，并用ImageJ进行半定量分析；采用结晶紫法和MALDI-TOF MS Biotyper分析抗生物膜作用，生物膜在塑料和不锈钢载体上形成；采用Callosobruchus maculatus和Megabruchidius dorsalis评价杀虫活性；统计分析使用JMP，进行单因素方差分析和Tukey HSD检验（P≤0.05）。

研究结果显示：

MPEO的化学组成：通过GC–MS鉴定出28种化合物，占精油的99.8%。MPEO以含氧单萜为主，其中薄荷醇占54.2%，异薄荷酮占8.4%，左旋薄荷醇占4.0%，异薄荷醇乙酸酯占5.7%，1,8-桉叶素占5.7%，芳樟醇占3.1%，异薄荷醇占2.7%。单萜烃含量较低，其中柠檬烯占2.7%，β-蒎烯占2.1%，α-蒎烯占1.5%。倍半萜中β-石竹烯占3.5%，β-波旁烯占0.6%。总含氧单萜占78.7%。因此，MPEO为薄荷醇化学型，薄荷醇及相关含氧单萜占主导。

圆盘扩散法：MPEO对所有测试细菌和酵母均显示抗菌活性，但低于抗生素对照。对粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌抑制圈最大，分别为17.67、17.33和16.33 mm。对产膜S. enterica也显示较强作用，为12.33 mm。酵母抑制较低，均小于10 mm。革兰氏阴性菌如大肠杆菌、S. enterica和结肠炎耶尔森菌为中等响应，约11 mm。纯(R)-(+)-limonene对粪肠球菌和产膜S. enterica最高为7.33 mm，对金黄色葡萄球菌为6.33 mm，整体为弱至中等。MPEO在所有测试微生物中均明显强于(R)-(+)-limonene，抑制圈常大于后者两倍。

最小抑制浓度：MPEO的MIC₅₀最低见于白色念珠菌（0.13 mg mL^?1）和克鲁斯念珠菌（0.27 mg mL^?1）；对S. enterica、热带念珠菌和光滑念珠菌为中等；对大肠杆菌、结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌需更高浓度；最高为粪肠球菌（2.77 mg mL^?1）和近平滑念珠菌（2.35 mg mL^?1）。MIC₉₀趋势相似。 (R)-(+)-limonene的MIC值一般高于MPEO，最低为S. enterica（1.90 mg mL^?1）和白色念珠菌（1.48 mg mL^?1），最高为粪肠球菌（5.88 mg mL^?1）。总体上，MPEO比(R)-(+)-limonene具有更低MIC₅₀和MIC₉₀，在革兰氏阳性菌和酵母中差异尤其明显。

气相抗菌活性：在草莓上，MPEO呈浓度依赖性抗菌作用。革兰氏阴性菌存活率从62.5 μL L^?1时的约85%降至500 μL L^?1时的23.42%、22.99%和24.83%；革兰氏阳性菌从约65%降至34.32–37.27%；念珠菌属下降最强，从42.58–47.90%降至6.66–12.84%；产膜S. enterica从95.67%降至64.28%。 (R)-(+)-limonene效果较弱，但李斯特菌在500 μL L^?1降至3.40%，产膜S. enterica降至24.45%。在李子中，MPEO使酵母存活降至30%以下，革兰氏阳性菌约34–41%，革兰氏阴性菌约64%，产膜S. enterica为55.62%；(R)-(+)-limonene整体较弱，酵母多数高于15%，产膜S. enterica为24.23%。在甜菜根中，MPEO随浓度升高对细菌抑制达94–96%，对产膜S. enterica达96.08%，而酵母在500 μL L^?1时抑制率降至约26%；(R)-(+)-limonene仅使细菌抑制约44–49%，酵母约10–15%。在番茄中，MPEO对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌抑制约76%，酵母约55%，产膜S. enterica为75.97%；(R)-(+)-limonene最敏感者为金黄色葡萄球菌33.51%、白色念珠菌34.47%、光滑念珠菌34.86%，产膜S. enterica为44.08%。总体而言，MPEO在气相原位中比(R)-(+)-limonene具有更强和更稳定的抗菌作用，且效果依赖果蔬基质。

抗生物膜试验：结晶紫试验显示，S. enterica对照吸光度为0.56或0.714 mg mL^?1。MPEO对S. enterica生物膜的MBIC₅₀为1.575 mg mL^?1，MBIC₉₀为1.58 mg mL^?1； (R)-(+)-limonene的MBIC₉₀为1.851 mg mL^?1，表明MPEO在更低浓度即可抑制生物膜形成。MALDI-TOF MS分析显示，MPEO处理后从第3天起即可见生物膜光谱明显改变，信号强度降低并向高质量区偏移； (R)-(+)-limonene处理后早期光谱与对照较接近，至第14天差异更明显。两种方法共同表明，MPEO起效更快，而(R)-(+)-limonene引起逐渐但明显的光谱变化。

杀虫活性：对Callosobruchus maculatus，100%浓度时两种处理几乎完全致死，MPEO为97.67%， (R)-(+)-limonene为100.00%；在50%、25%、12.5%和6.25%时，(R)-(+)-limonene均强于MPEO，分别为84.33%对78.33%、75.33%对60.67%、63.33%对31.00%、24.00%对0.00%；3.125%和对照组均无活性。对Megabruchidius dorsalis，100%时MPEO为98.67%， (R)-(+)-limonene为100.00%；50%、25%、12.5%和6.25%时，(R)-(+)-limonene分别为91.33%、78.67%、66.67%和36.33%，均高于MPEO的77.67%、60.33%、31.67%和0.00%。因此，(R)-(+)-limonene在6.25–50%范围内比MPEO杀虫活性更强，而在100%时两者几乎同样有效。

讨论部分总结：本研究MPEO化学组成以薄荷醇为主，伴随异薄荷酮、异薄荷醇乙酸酯、1,8-桉叶素和芳樟醇等，属于薄荷醇化学型。原文指出，薄荷醇是MPEO生物活性的主要贡献者，但柠檬烯、α-蒎烯和β-石竹烯等次要萜烯可与主要化合物协同拓宽抗菌谱。MPEO与(R)-(+)-limonene均被广泛研究，但纯柠檬烯常弱于完整精油，支持多化合物协同。研究人员的结果确认MPEO抑制所有测试微生物，且对革兰氏阳性菌强于革兰氏阴性菌和念珠菌属酵母；这与完整精油通常对革兰氏阳性菌作用更强、革兰氏阴性菌外膜脂多糖层阻碍疏水萜烯渗透一致。MPEO抑制圈一致大于(R)-(+)-limonene，支持主要成分与次要成分间协同。酵母敏感性较低，与文献中标准扩散试验下MPEO对酵母作用较弱一致。柠檬烯作为单成分表现较弱且可变，其抗菌性能常低于完整精油，并受基质和环境条件影响。原位气相处理中，MPEO对草莓、李子、甜菜根和番茄的微生物抑制均强于(R)-(+)-limonene；柠檬烯活性明显依赖浓度和时间，而MPEO在多种果蔬中保持较强且稳定的效果。抗生物膜方面，结晶紫试验显示MPEO在较低浓度即显著减少S. enterica生物膜，MALDI-TOF MS显示MPEO引起更广泛光谱改变，说明其更全面干扰生物膜结构；柠檬烯虽有一定抗生物膜活性，但不稳定且更依赖浓度。杀虫试验出现相反趋势：100%时两者几乎同样有效，但亚最大剂量下柠檬烯持续优于MPEO，可能因昆虫更易受高挥发性柠檬烯快速穿透呼吸系统影响。总体而言，MPEO在抗菌和抗生物膜情境中更有效，而柠檬烯显示更强杀虫潜力。本研究新颖性在于在体外、原位、生物膜和杀虫多个模型中直接并列比较完整精油与其单成分，并用MALDI-TOF MS监测生物膜相关光谱变化。原文也指出局限性：抗菌和杀虫试验在受控实验室条件下进行，实际商业或大规模应用可能不同；MPEO和(R)-(+)-limonene高挥发性可能影响稳定性、持久性和有效浓度；原位试验并非模拟商业采后贮藏。

研究结论翻译：本研究结果证实了假设，即MPEO比其分离成分(R)-(+)-limonene表现出更广和更强的抗菌及抗生物膜活性，突显多种萜烯间协同相互作用的重要性。该工作的新颖性在于整合方法，将体外、原位、抗生物膜和杀虫试验与MALDI-TOF MS分析生物膜光谱变化相结合。这些结果为植物精油及其成分的作用机制提供了新见解。从实践角度看，MPEO可被推荐为食品储存和保护的天然生物保鲜剂，以及有害生物综合治理的组成部分。尽管在某些微生物模型中效果较弱，(R)-(+)-limonene可作为适用于气相应用的挥发性补充剂。总体而言，本研究强调植物精油及其成分作为合成防腐剂和杀虫剂可持续替代品的潜力。