靶向Bacillus Calmette–Guérin (BCG)外膜蛋白的单克隆抗体通过识别BCG_2760c与MPB83提供抗结核保护

《Transboundary and Emerging Diseases》：Monoclonal Antibodies Targeting Bacillus Calmette–Guérin (BCG) Outer Membrane Proteins Confer Protection Against Tuberculosis

　　

由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）引起的结核病（tuberculosis, TB）是持续存在的全球健康危机，仍是世界上主要的感染性致死原因。细菌细胞壁中分布有大量外膜蛋白（outer membrane proteins, OMPs），但被鉴定并表征为可诱导抗TB保护性抗体的抗原的蛋白较少。研究人员用去垢剂N-octyl-β-D-glucopyranoside提取BCG的OMPs，并将提取蛋白免疫小鼠以构建抗体库。随后，该抗体库经HAT/HT筛选，获得5株靶向OMPs且滴度较高的特异性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs），命名为9C5、14E9、9F6、7B10和6F4。在5株mAbs中，9C5、14E9和9F6可增强巨噬细胞吞噬作用、抑制外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中分枝杆菌生长，并促进巨噬细胞中吞噬体与溶酶体融合。研究人员用上述3株抗体免疫小鼠后以M. bovis攻击，其中14E9和9C5两株抗体对TB感染表现出预防作用。此外，抗体9C5还显示出治疗作用，表现为肺部载量显著降低和肺部病变改善。通过共免疫沉淀（coimmunoprecipitation, co-IP）联合质谱（mass spectrometry, MS）鉴定了9C5和14E9两株抗体靶向的抗原，结果显示抗体9C5和14E9分别识别BCG_2760c和MPB83。该研究促进了对BCG疫苗接种诱导的宿主保护性体液免疫以及抗体在TB疫苗设计和开发中作用的理解。

结核病（tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）引起，仍是全球主要感染性致死原因。抗生素曾被视为防治TB最有效方式，但多药耐药TB（multidrug-resistant TB, MDR-TB）和广泛耐药TB（extensively drug-resistant TB, XDR-TB）带来新挑战，因此亟需新型防治策略。潜伏性TB感染（latent TB infection, LTB）患者来源抗体可增强吞噬溶酶体成熟、炎症小体激活并抑制Mtb胞内存活；高暴露医护人员抗体可在小鼠中提供保护，而全菌耗竭抗体消除保护效果，提示保护性抗体的靶抗原位于Mtb表面。外膜蛋白（outer membrane proteins, OMPs）位于细菌最外层，具有表面暴露、高免疫原性和跨菌株保守性，是候选疫苗抗原。卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin, BCG）是唯一获批的人用TB疫苗，可诱导长寿命记忆B细胞和特异性抗体反应，但被鉴定为可诱导保护性抗体的OMP抗原仍少。为此，研究人员从BCG OMPs免疫小鼠建立抗体库，筛选靶向OMPs的mAbs，在细胞和小鼠模型中评价保护性，并鉴定其靶抗原。

研究人员用去垢剂N-octyl-β-D-glucopyranoside提取BCG OMPs，免疫小鼠后经HAT/HT筛选获得5株高滴度mAbs：9C5、14E9、9F6、7B10和6F4。其中9C5、14E9和9F6可增强巨噬细胞吞噬、抑制外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中分枝杆菌生长、促进吞噬体与溶酶体融合。小鼠预防模型中，14E9和9C5可降低M. bovis肺部定植；治疗模型中，9C5降低肺载量并改善肺病变。co-IP/MS显示9C5和14E9分别识别BCG_2760c和MPB83。该研究加深了对BCG疫苗诱导保护性体液免疫的理解，并为TB抗体治疗和疫苗设计提供新策略。

关键技术方法不超过250字：提取BCG OMPs并用N-octyl-β-D-glucopyranoside增溶，免疫BALB/c小鼠，经酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和HAT/HT筛选、杂交瘤技术制备mAbs。用J774a.1巨噬细胞、小鼠全血来源PBMCs、流式细胞术、共聚焦显微镜及分枝杆菌生长抑制试验（mycobacterial growth inhibition assay, MGIA）进行体外评价。采用C57BL/6J小鼠预防和治疗模型，以M. bovis C68004经i.n.感染、i.p.给予抗体。用co-IP/MS鉴定抗原。菌株包括BCG Pasteur 1173P2和M. bovis C68004；J774a.1来自国家细胞资源库；动物实验经中国农业大学伦理批准。

研究结果：
3.1 OMP制备与鉴定。通过差速离心和N-octyl-β-D-glucopyranoside从对数期BCG分离OMPs，BCA测得浓度约0.7 mg/mL，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示15–100 kDa条带。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定蛋白，并按UniProt亚细胞定位预测分类，其中286个为细胞膜蛋白、231个为胞质蛋白、49个为细胞壁蛋白，多数定位未知。Western blot（WB）分析显示提取物含HBHA、MctB和OmpA等OMP成分，但存在胞质污染。透析去除去垢剂。
3.2 mAbs产生。OMPs加佐剂免疫小鼠后血清抗体滴度升至1:1,024,000；CD16/CD32阻断可消除OMP免疫血清增强巨噬细胞吞噬的作用；血清含IgG和IgM等同种型。杂交瘤获得16株稳定分泌mAbs的细胞系，选取对BCG和M. bovis亲和力最高的5株：9F6、9C5、14E9、6F4、7B10。纯化抗体SDS-PAGE显示重链和轻链；6F4、9F6、14E9为IgG_2b，9C5、7B10为IgG₁。这些抗体可结合BCG和M. bovis，提示表位在两者间高度保守。
3.3 体外筛选抗TB保护性mAbs。基于流式细胞术，14E9、9F6、9C5显著增强J774a.1吞噬，6F4和7B10抑制或无影响。0 h和24 h胞内生存显示9C5、14E9、9F6限制BCG复制。PBMCs中，除9F6和6F4外，所有抗体可同时抑制BCG和M. bovis胞内生长；9F6和6F4仅抑制其中一种，可能与抗原暴露水平有关。共聚焦显示9F6、9C5、14E9显著增强吞噬体-溶酶体融合；7B10和6F4不显著影响吞噬但显著增强融合。
3.4 mAbs体内保护效果。预防模型中，14E9、9C5、9F6免疫后M. bovis攻击，器官系数无显著差异；14E9或9C5降低肺部细菌载量，但病理损伤与PBS组无差异。7B10和6F4无预防效果。治疗模型中，9C5和14E9治疗组体重随治疗逐渐增加，器官系数未显著下降；9C5降低肺载量约1 log，并减轻肺病变，表现为炎症浸润稀疏、黏液分泌轻微、肺泡间隔(+)；14E9和PBS组病变更重。结论：9C5可减少M. bovis肺部定植并改善肺组织病理。
3.5 抗原鉴定。ELISA排除已知表面抗原后，14E9识别MPB83，WB确认，对纯化MPB83、BCG、M. bovis滴度分别为1:256,000、1:16,000、1:32,000。9C5未识别已知表面蛋白，免疫印迹显示结合粗OMP中25–35 kDa条带；co-IP/MS鉴定并排除非特异结合后确认9C5靶向BCG_2760c，对BCG、M. bovis和对应蛋白滴度分别为1:32,000、1:32,000、1:128,000。9C5和14E9与BCG和M. bovis交叉反应，并与M. kansasii ATCC 12478、M. fortuitum DSM 46621、M. colombiense 10B和M. abscessus等非TB分枝杆菌交叉反应，提示可用于TB及部分非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）感染。

讨论总结：讨论指出，分枝杆菌细胞壁抗原丰富，但已知可诱导保护性抗体的抗原仍少，OMPs免疫后构建抗体库有助于发现更多抗原。膜蛋白疏水性强，提取困难，去垢剂可改善。先前用Triton 114提取Mtb膜蛋白，鉴定1417个蛋白，其中54个为OMPs；但Triton 114和Triton X-100因临界胶束浓度低而不易去除，可能抑制免疫应答。N-octyl-β-D-glucopyranoside临界胶束浓度较高，可透析去除，能高效分离分枝杆菌OMPs；本研究中该处理免疫小鼠后抗体滴度显著升高。9C5靶向BCG_2760c，14E9识别MPB83。MPB83为分泌性分枝杆菌脂蛋白，是已用于亚单位疫苗的保护抗原；既往MBS43抗体可减轻肺病变和延长生存但不降低器官菌载。本研究中14E9靶向MPB83并降低M. bovis肺部定植，差异可能源于表位特异性、实验参数、感染途径和模型。治疗模型中mAb经i.p.给药，而与i.n.感染途径不同；i.p.可一致且可定量递送、进入系统循环并扩散至肺组织、模拟临床被动免疫。14E9可介导巨噬细胞吞噬、增强溶酶体融合、抑制PBMCs中BCG或M. bovis生长，这些机制尚未在MPB83诱导抗体中报道。BCG_2760c与M. tuberculosis H37Rv Rv2744c和M. bovis AF2122/97 100%同源；Rv2744c编码PspA，Psp系统必需成分，调节脂滴稳态和非复制持留期M. tuberculosis生存。PspA在调节脂质稳态时可转运至细胞壁和细胞膜，为抗体作用提供窗口。PspA在S. pneumoniae中为保护抗原，与肺炎球菌溶血素融合可增强疫苗效力，诱导补体C3沉积；反向遗传技术将其替换流感A神经氨酸酶构建二价疫苗，可保护小鼠。局限性包括保护性抗原数量仍少，可能与抗体库容量、抗原质量和筛选方案有关；抗体均为鼠源，应用受限，需人源化改造；体外和体内保护机制仍不清。

研究结论翻译：在这项研究中，尽管研究人员揭示了一些保护性抗原，但与分枝杆菌染色体中分布的丰富蛋白数量相比，这些抗原数量仍然较低。这可能由多种原因造成，包括抗体库容量、抗原质量和筛选方案。尽管研究人员鉴定了这些保护性抗体，但由于这些抗体均为鼠源抗体，其应用范围有限。研究人员部署了针对所有抗体的人源化改造分类以扩大其应用。此外，这些保护性抗体在体外和体内的潜在机制仍不清楚。因此，未来研究值得聚焦这些抗体，无论是特异性靶向某些区域还是介导其他免疫细胞控制结核病感染。