《Lab on a Chip》：Label-free all-electrical tracking of individual and collective cell migration on a megapixel CMOS capacitance sensorOpen Access
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无标记的全电学追踪贴壁细胞迁移可为组织修复、炎症反应或癌症进展等生物学过程提供重要见解。然而，由于对比度低以及细胞形态和数量频繁变化，使用光学显微镜对未标记的动物细胞进行可视化仍然具有挑战性。一种有前景的替代方案是利用电容测量，该方法对细胞在电极表面的黏附敏感
无标记的全电学追踪贴壁细胞迁移可为组织修复、炎症反应或癌症进展等生物学过程提供重要见解。然而，由于对比度低以及细胞形态和数量频繁变化，使用光学显微镜对未标记的动物细胞进行可视化仍然具有挑战性。一种有前景的替代方案是利用电容测量，该方法对细胞在电极表面的黏附敏感。然而，此前的示例通常使用面积大于单细胞的电极，导致对多个细胞产生平均化读数。在此，研究人员展示了一种基于电容传感器阵列的无标记活细胞追踪技术，该阵列在超过1平方厘米的面积上以10微米间距分布超过一百万个像素。研究人员证明，单细胞形态可以被清晰分割，并利用光流法重建迁移和增殖动态。研究人员进一步追踪了多细胞球体的扩散，揭示了由集体前导细胞“前沿”引领的快速移动外周区域。最后，研究人员展示了毫米级蜂窝状组织的无标记成像，无需传统显微镜通常需要的多图像拼接。研究人员利用电学可编程电极间距的互电容测量来映射这些工程组织的拓扑特征。总体而言，CMOS电容成像阵列能够实现从单细胞到大型组织的无标记成像，以便携且可扩展的形式适用于光学显微镜难以获取的环境中。
论文解读：基于百万像素CMOS电容传感器的无标记全电学细胞迁移追踪
一、研究背景与问题
动态测量动物细胞的形态、迁移和增殖对于理解组织稳态、伤口愈合和疾病进展至关重要。在传统实践中，细胞追踪依赖于对延时光学图像序列进行分割并将细胞位置跨时间关联成轨迹。然而，光学成像在准确重建细胞运动方面存在多重障碍：贴壁细胞薄且光学透明，在明场、相差及其他无标记显微技术下难以可靠分割；荧光标记虽能提供更均匀的亮度和更易分割的图像，但频繁的延时成像会导致光漂白和光毒性；此外，单细胞迁移与增殖（约10微米尺度）和组织尺度重组（100微米至毫米级）之间存在尺度失配，后者往往远超单一光学视野，因此需要对部分重叠区域进行顺序成像并数字拼接，过程繁琐。基于阻抗或电容传感的电学测量提供了一条无标记、便携、低功耗的细胞测量路径。早期基于电细胞-基底阻抗传感（ECIS）的工作使用远大于单细胞的电极，仅能获得群体水平的平均读数，无法解析单细胞行为。现代半导体技术为集成CMOS电路的高密度微电极阵列（MEA）提供了机会，可实现高时空分辨率的无标记细胞监测。
二、研究内容与意义
研究人员开发了一种定制的一百万像素CMOS-MEA电容成像传感器芯片，包含1024×1024个电极像素，间距10微米，有效传感面积达104 mm2，可在超过1平方厘米的面积上实现细胞级分辨率的无标记活细胞成像。该平台实现了从单细胞形态分割、迁移轨迹重建到多细胞球体集体迁移分析以及毫米级工程组织成像的多尺度应用，为难以获取光学显微镜的环境中开展细胞生物学研究提供了可扩展的解决方案。
三、关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：基于180 nm CMOS工艺定制设计的电容传感芯片，通过像素内晶体管网络在12.5 MHz高频下切换电极电压进行电容测量；利用自电容模式进行单细胞成像，通过互电容模式配合电学可编程的虚拟像素（virtual pixel）测量实现深度敏感的形貌探测；采用Farneb?ck光流算法（OpenCV实现）结合k近邻图预测和匈牙利分配算法重建细胞轨迹；使用Cellpose深度学习分割算法（cyto3模型）对电容图像进行细胞分割；利用COMSOL Multiphysics静电模块进行有限元仿真以解释互电容信号与组织形貌的关系。细胞来源包括人乳腺上皮细胞（MCF-10A）和三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231），其中MDA-MB-231细胞转染了Z-CAD双传感器或细胞质GFP。
四、研究结果
A. 单细胞电容成像检测。 研究人员将电容成像与荧光成像进行对比，发现两者在细胞核等特征上定性一致，但电容成像对片状伪足等外周亚细胞结构具有更高对比度。电容图像的直方图显示出更锐利的前景/背景分割阈值（约60 fF），而荧光图像阈值不明显。通过Cellpose分割比较，荧光图像倾向于系统性低估细胞面积，而偏心率等形状指标在两种成像方式间相关性良好。主成分分析确认两种来源的细胞掩膜在形态特征空间中有显著重叠。MCF-10A细胞在芯片上43小时内增殖为融合单层，倍增时间约20小时，证实了芯片的生物相容性。
B. 单细胞迁移追踪。 在约5%稀疏接种密度下，研究人员可在20小时内识别数千个分散于芯片表面的细胞。电容成像能够在整个分裂过程中持续追踪细胞：母细胞在2小时内逐渐圆缩，随后重新铺展并分裂为两个子细胞，线扫描显示单一谷值在4小时内分解为两个不同谷值。通过结合光流预测与匈牙利匹配的追踪算法，重建的轨迹与叠加电容图像中的细胞痕迹高度一致，并能正确重建分裂后的子细胞轨迹。通过合成噪声、降低空间分辨率和降低帧率的对照实验，研究人员确定了追踪性能的边界条件。与相差显微镜在组织培养塑料上的结果相比，CMOS-MEA上的细胞迁移指标（平均速度、方向性、扩散系数）相当，且芯片视野（156 mm2）远大于光学显微镜单视野（2.08 mm2）。
C. 多细胞球体集体迁移分析。 研究人员将约7200个MDA-MB-231细胞聚集形成的球体（初始直径约350微米）转移至芯片表面，观察到其在50小时内逐渐扁平化并扩展。有效半径随时间呈幂律增长，指数α≈0.4，与基于黏弹性液滴“主动润湿”的标度论证相符。光流分析显示集体迁移在球体外周最快且呈径向向外，快速移动的“前导细胞”区域局限于最外层约300微米，中心区域存在停滞区。径向速度剖面在不同时间呈现自相似性，外周区域的细胞协调性逐渐增强，速度场空间相关长度在10至50小时内维持约100微米的特征尺度。
D. 虚拟像素互电容深度敏感测量。 通过将相邻电极分组为不同尺寸的“虚拟像素”（V=1至V=8），研究人员利用互电容测量获取组织形貌信息。在球体扩散23小时时，V=1的互电容高于背景培养基，而V≥2时低于背景。COMSOL仿真表明，随着虚拟像素增大，对抬升形貌的检测临界高度从4微米增加至60微米。半球帽加平面层的仿真几何在定性上与实验测量一致。时间序列测量显示，外周位置在24至40小时仅V=1电容增加（对应单层前导细胞），40小时后V=4、8的互电容下降而V=2保持（对应细胞层增厚）；中心位置的V=1电容在16小时后增加（细胞黏附增强），V=4、8的互电容逐渐下降（球体主体铺展）。
E. 毫米级蜂窝组织的空间异质性扩散。 研究人员制备了由140000个MCF-10A细胞组成的蜂窝状组织（直径3毫米，含六个直径约600微米的圆形空隙），转移至芯片表面后观察到其黏附与铺展过程。电容成像在0小时几乎不可见（黏附极弱），随后8至12小时内组织明显铺展并超出原始边界，铺展面积随时间线性增加。光流分析显示中心存在停滞区，外周区域向未占用区域协调迁移；内部前沿向空隙迁移速度（39.96微米/小时）快于外部边界前沿（28.91微米/小时）。虚拟像素互电容测量显示，未黏附组织在V=1时几乎不可见，随虚拟像素增大逐渐可见，V=2显示高于培养基的互电容而V≥4显示低于培养基，与球体测量结果一致。
五、讨论与结论
研究人员讨论指出，该CMOS-MEA电容成像平台具有细胞类型无关性，10微米像素足以解析贴壁单细胞的亚细胞特征。当前空间分辨率低于典型光学显微镜，未来可通过基于荧光图像训练的深度学习超分辨率算法提升；将电极间距缩小至5微米或以下在更成熟的CMOS工艺节点（如90/65 nm）中是可行的，有望应用于淋巴细胞或中性粒细胞等较小且弱黏附的免疫细胞。每15分钟的延时成像足以恢复与组织培养塑料上一致的单细胞轨迹，且能在分裂事件中持续解析单细胞，这是荧光成像常难以实现的。未来可基于实时分割与追踪实现自适应成像，选择性读取低电容区域附近的像素。虚拟像素互电容测量可恢复额外的形貌信息，为三维标本的无标记成像提供了可能。总体而言，CMOS电容成像平台可在光学显微镜难以获取的环境中，为发育和疾病中的集体细胞迁移研究提供新的见解。
