《Advanced Biology》：Fibro-Adipogenic Progenitors From Skeletal Muscle Enhance Microvascular Angiogenesis in a 3D Model
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骨骼肌组织具有高度血管化特征，血管生成（angiogenesis）在肌肉稳态维持和再生过程中均发挥关键作用。尽管纤维脂肪祖细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）在骨骼肌多种生理过程的调控中具有重要性，但关于肌肉驻留FA
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骨骼肌组织具有高度血管化特征，血管生成（angiogenesis）在肌肉稳态维持和再生过程中均发挥关键作用。尽管纤维脂肪祖细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）在骨骼肌多种生理过程的调控中具有重要性，但关于肌肉驻留FAPs在促进微血管血管生成中的作用，目前知之甚少。为更深入理解FAPs对血管生成的影响，研究人员将FAPs与脂肪来源的微血管片段（microvascular fragments, MVFs）在三维纤维蛋白水凝胶（fibrin hydrogels）中共培养。研究人员进一步检测了在棕色脂肪诱导培养基（brown adipogenic induction media, BAM）中预培养FAPs是否会影响其促进MVF血管生成的能力。与单独培养的MVFs相比，MVFs与对照FAPs或BAM FAPs共培养5天后，表现出显著的微血管网络形成，血管百分比面积（vessel percentage area）和平均血管长度（average vessel length）均显著增加。在共培养前经BAM处理的FAPs，与对照FAPs共培养的MVFs相比，其血管网络发育发生改变，表现为平均血管长度显著增加。综上，这些结果表明FAPs是微血管血管生成的关键调控因子，且BAM FAPs在促进平均血管长度增加方面具有更强的能力。当前研究结果支持将FAPs与MVFs联合移植以及调控FAP促血管生成特性，作为在损伤和疾病背景下增强骨骼肌血管生成的潜在治疗策略。
一、研究背景与科学问题
骨骼肌是人体中高度血管化的组织之一，血管生成（angiogenesis），即从既有血管网络中形成新生血管的过程，在运动适应和骨骼肌再生中均发挥关键作用。微血管系统与肌肉微环境中其他细胞类型之间的交互作用，如卫星细胞（satellite cells, SCs）、免疫细胞和成纤维细胞等，已被广泛研究以阐明骨骼肌血管生成过程中细胞间相互作用的机制。例如，卫星细胞与毛细血管密切关联，表达丰富的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），并在体外促进血管出芽。然而，纤维脂肪祖细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）对骨骼肌微血管系统的影响，尤其是对血管生成过程的调控作用，长期以来未受到足够关注。
FAPs是肌肉驻留的间充质干细胞，表达血小板衍生生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor α, PDGFRα）、干细胞抗原-1（stem cell antigen-1, SCA-1）和CD34，位于肌纤维之间的间质空间，在骨骼肌稳态维持和再生中发挥关键作用。值得注意的是，FAPs在体内与骨骼肌毛细血管紧密相邻，提示其可能参与内皮细胞和血管稳态的调控。已有研究显示，后肢缺血损伤后注射未分化FAPs可促进组织血运重建和愈合。此外，FAPs还可产生VEGFA，以损伤特异性方式影响肌肉血运重建。更重要的是，向棕色/米色脂肪细胞表型分化的FAPs（以解偶联蛋白1（uncoupling protein 1, UCP-1）表达为特征）在多种骨骼肌损伤中具有高度促再生作用，且棕色FAP表型可能进一步影响血管生成。然而，关于FAPs与微血管之间相互作用以及棕色脂肪诱导对其影响的研究相对较少。因此，本研究旨在：（1）在三维细胞培养模型中确定FAPs对微血管血管生成的影响；（2）探究诱导FAPs向棕色脂肪表型分化是否影响其促血管生成特性。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过磁激活细胞分选（magnetic-activated cell sorting, MACS）纯化FAPs，将其在标准生长培养基（growth media, GM）或棕色脂肪诱导培养基（brown adipogenic induction media, BAM）中预培养3天，随后与新鲜分离的脂肪来源微血管片段（microvascular fragments, MVFs）在纤维蛋白水凝胶中共培养5天，通过共聚焦显微镜成像并分析血管网络形成情况。流式细胞术确认了MACS分选FAPs群体的纯度，其中98.5%和97.1%的细胞分别表达PDGFRα和SCA-1。
研究发现，FAPs与MVFs共培养1天后即获得血管周围位置，与MVF结构直接接触。共培养5天后，MVFs与FAPs共培养组表现出显著更 robust 的血管网络发育，形成由更长更粗血管组成的网络，且经常观察到管腔结构。在共培养体系中，FAPs常定位于血管外周，表明至少部分FAPs获得了与体内观察相似的血管周围位置。单独培养FAPs的凝胶中未形成血管网络。
通过实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR）分析，BAM FAPs表达了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ），这是FAP脂肪生成的关键遗传调控因子，在对照FAPs中未可靠检测到。更重要的是，BAM FAPs的UCP-1表达量较对照FAPs显著升高约13.9倍。线粒体生物发生基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PGC-1α）的表达在两组间无显著差异，尽管BAM FAPs呈现略微上升趋势。这些数据证实BAM FAPs正处于向棕色/米色脂肪细胞表型诱导的过程中。
定量分析显示，与MVFs单独培养相比，MVFs与对照FAPs或BAM FAPs共培养均显著增加了血管百分比面积和平均血管长度，同时显著降低了总连接数、连接密度、总端点数以及平均空隙度（lacunarity）。重要的是，与对照FAPs共培养相比，BAM FAPs共培养显著增加了平均血管长度。尽管未达到统计学显著性，BAM FAPs组的血管百分比面积和总血管长度较对照FAPs组呈现上升趋势。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：从Lewis大鼠后肢骨骼肌组织中分离FAPs并进行MACS分选，获得PDGFRα?/SCA-1?/CD31?/CD45?的FAPs群体；从Sprague Dawley大鼠附睾、腹股沟和皮下脂肪组织中分离MVFs；将FAPs在BAM中预培养3天以诱导棕色脂肪表型；通过RT-PCR检测PPARγ、UCP-1和PGC-1α等棕色脂肪生成关键基因的表达；将MVFs与FAPs在三维纤维蛋白水凝胶中共培养5天；通过共聚焦显微镜成像和AngioTool软件进行血管网络定量分析。
四、研究结果
4.1 实验设计与FAP流式细胞术表征
FAPs经MACS纯化后，流式细胞术确认98.5%和97.1%的细胞分别表达PDGFRα和SCA-1，证实了FAPs群体的纯度。
4.2 FAPs与MVFs共培养定位于血管并增强血管生成
MVFs在纤维蛋白水凝胶中培养1天后表达GS Lectin I，呈现分离微血管段的典型形态。FAPs与MVFs共培养1天后即获得血管周围位置，与MVF结构直接接触。共培养5天后，MVFs与FAPs共培养组表现出显著更 robust 的血管网络发育，形成由更长更粗血管组成的网络，且FAPs常定位于血管外周。单独培养FAPs的凝胶中未形成血管网络。
4.3 BAM预刺激的FAPs表达棕色脂肪诱导关键遗传标志物
RT-PCR分析显示，BAM FAPs表达PPARγ，而对照FAPs中未可靠检测到该基因。BAM FAPs的UCP-1表达量较对照FAPs显著升高约13.9倍。PGC-1α表达在两组间无显著差异，尽管BAM FAPs呈现略微上升趋势。
4.4 对照FAPs和BAM FAPs增强MVF血管网络发育，BAM FAPs显著增加平均血管长度
AngioTool定量分析显示，与MVFs单独培养相比，MVFs与对照FAPs或BAM FAPs共培养均显著增加了血管百分比面积和平均血管长度，同时显著降低了总连接数、连接密度、总端点数以及平均空隙度。与对照FAPs共培养相比，BAM FAPs共培养显著增加了平均血管长度。BAM FAPs组的血管百分比面积和总血管长度较对照FAPs组呈现上升趋势，但未达到统计学显著性。
五、讨论与结论
本研究表明FAPs是微血管血管生成的关键调控因子。FAPs在影响血管网络形成过程中定位于MVFs周围，与其在体内的位置一致，也类似于间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）与内皮细胞共移植时获得血管周围位置并促进血管网络生成的现象。FAPs与MVFs建立直接细胞接触并采用血管周围位置以促进血管生成过程。
对照FAPs和BAM FAPs均能增加血管百分比面积和平均血管长度，同时降低血管网络的整体连接性和出芽。BAM FAPs较对照FAPs具有更强的促进平均血管长度增加的能力。棕色/米色脂肪细胞以高度血管化为特征并产生VEGF-A，棕色/米色表型与血管生成程序之间存在紧密协调的关系，这可能部分解释了BAM FAPs共培养组平均血管长度增加的原因。此外，人类FAPs经棕色脂肪刺激后表达增加的胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1, IGF-1）和卵泡抑素（follistatin）均与骨骼肌血管生成促进有关。
FAPs对MVF血管生成的显著影响对细胞治疗和骨骼肌疾病与损伤中血管生成研究具有重要启示。MVFs已被广泛用于再生医学和细胞治疗应用。在骨骼肌缺血性损伤背景下，MVF移植已被证明可显著改善血流、增加毛细血管密度并减轻组织坏死。FAPs增加MVF血管生成的发现表明，MVFs和FAPs可能作为更有效的组合细胞疗法，在缺血再灌注损伤和严重肢体缺血等骨骼肌缺血性损伤后诱导血管生成。
研究结论：本研究证明FAPs是微血管血管生成的关键调控因子，且向棕色脂肪表型诱导的FAPs可促进平均血管长度增加的血管网络发育。综上，这些发现表明MVFs与FAPs的联合移植以及靶向增强FAP介导的血管生成，可能是改善骨骼肌损伤和疾病中血管化的新型治疗策略。
