NAD+类似物：解码PARP介导的ADP-核糖基化生物化学的化学工具

《RSC Chemical Biology》：NAD+ analogues for decoding the biological chemistry of PARP-mediated ADP-ribosylationOpen Access

　　

ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）是一种依赖NAD+的翻译后修饰（post-translational modification, PTM），调控DNA修复、转录、抗病毒防御和应激适应。然而，其瞬时性和异质性限制了对其机制的深入理解。化学修饰的NAD+类似物已成为克服这些障碍不可或缺的化学生物学工具。通过在PARP酶耐受的位置对NAD+骨架进行功能化修饰，这些探针能够实现ADP-核糖基化底物的捕获与富集、writer特异性标记、PAR链结构调控、reader鉴定以及实时成像。本综述按探针功能和生物学应用分类，总结了NAD+类似物开发的最新进展。研究人员重点阐述了这些化学工具如何将ADP-核糖基化研究从描述性检测推向机制性探究，并讨论了该领域的未来方向。

主体内容总结

1. 引言

ADP-核糖基化是一种化学上复杂的翻译后修饰（post-translational modification, PTM），调控多种细胞过程，包括DNA损伤修复、细胞周期进程、抗病毒防御和应激适应。ADP-核糖基化的失调与人类疾病密切相关：DNA损伤应答中PARP酶（poly(ADP-ribose) polymerase）的过度激活有助于癌细胞存活和治疗耐药，而ADP-核糖基化动力学受损则与神经退行性疾病、炎症性疾病和病毒感染相关。与磷酸化或乙酰化等经典PTM不同，ADP-核糖基化涉及将一个或多个ADP-核糖单元从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺）共价转移至靶标生物分子，通常形成线性或分支的聚ADP-核糖（poly(ADP-ribose), PAR）链。内源性ADP-核糖基化具有瞬时性，PAR链在激活后数秒至数分钟内快速周转，且结构异质性显著，涵盖不同受体残基上的单ADP-核糖基化（mono-ADP-ribosylation, MARylation）和聚ADP-核糖基化（poly-ADP-ribosylation, PARylation），不同酶亚型常产生化学上难以区分的产物。基于ADP-核糖从NAD⁺共价转移至蛋白底物的核心反应原理，对NAD⁺骨架进行功能化修饰已成为深入研究该PTM的关键策略。

2. PARP催化的ADP-核糖基化：writers、products、readers和erasers

PARP催化的ADP-核糖基化可理解为由NAD⁺化学驱动的动态writer–product–reader–eraser循环。PARP酶以NAD⁺为直接ADP-核糖供体，将ADP-核糖转移至蛋白质或其他生物分子，生成单ADP-核糖基化产物或聚ADP-核糖链。人类细胞编码17个PARP家族成员，多数主要催化单ADP-核糖基化，而PARP1、PARP2和端锚聚合酶（tankyrases, PARP5a/5b）可支持PAR链形成。由于最终ADP-核糖产物通常不保留生成它的writer的明确记录，writer归属仍是核心分析挑战。

2.1 NAD⁺向MAR和PAR信号的催化转化

在分子水平上，PARP催化的ADP-核糖基化始于NAD⁺在催化裂隙中的结合及受体位点对烟酰胺核糖C1′位的攻击。烟酰胺-核糖键断裂释放烟酰胺，经氧碳正离子样过渡态后，ADP-核糖部分转移至受体。丝氨酸已被确立为HPF1依赖性PARP1/2信号中的主要受体残基，而谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸等残基在不同情境中亦有报道。对于可形成聚合物的PARP，连续ADP-核糖单元通过核糖-核糖糖苷键连接，生成在长度、分支、连接组成和局部密度上各异的PAR链。

2.2 Reader蛋白与ADP-核糖信号的传播

ADP-核糖结合模块，包括macrodomain、WWE结构域、PBZ基序及其他PAR结合元件，识别ADP-核糖基化底物或PAR链的特征并将其转化为细胞应答。不同reader蛋白的偏好各异：有些优先结合MAR，有些偏好短PAR链、长聚合物、分支结构或在特定蛋白质或染色质环境中呈现的ADP-核糖。链终止类似物可生成受限PAR结构以测试链长依赖性，光反应性类似物可通过共价交联捕获弱或瞬时reader相互作用。

2.3 Eraser酶与ADP-核糖信号的寿命

ADP-核糖基化高度可逆。聚ADP-核糖糖水解酶（poly(ADP-ribose) glycohydrolase, PARG）水解PAR内的核糖-核糖连接，ARH家族成员、TARG1、MacroD1和MacroD2则移除或重塑特定ADP-核糖连接。探针选择和采样时间应考虑所研究修饰的形成与去除动力学。

3. NAD⁺识别作为探针设计的化学基础

烟酰胺环直接参与ADP-核糖基化的切割步骤并在催化过程中以烟酰胺形式释放，因此该区域的 bulky 修饰通常强烈影响底物识别和酶促周转。在bump-and-hole策略中，PARP催化口袋内的工程化突变产生互补空腔，以容纳空间位阻较大的NAD⁺类似物。两个核糖单元提供第二层设计逻辑：烟酰胺连接的核糖参与反应性ADP-核糖单元，腺苷连接的核糖有助于NAD⁺定向和PAR链延伸。腺嘌呤碱基是功能多样化最灵活的位点，N6、C2和C8位通常可耐受叠氮、炔烃、荧光团、亲和标签或光反应基团。焦磷酸桥通过离子和氢键相互作用稳定NAD⁺结合，但其高电荷密度和严格几何要求使主要修饰空间有限。焦磷酸基团使NAD⁺高度极化和多电荷，严重限制膜通透性，将多数应用局限于纯化系统、裂解液或透化细胞。

4. NAD⁺类似物的主要类别

4.1 用于绘制ADP-核糖基化生物大分子的捕获探针

放射性标记的NAD⁺和脱氧衍生物实现了生化系统中MAR化和PAR化蛋白的放射自显影检测。可点击NAD⁺类似物通过在NAD⁺骨架上安装小型生物正交手柄来克服这些局限，酶促掺入后可通过点击化学偶联荧光团或生物素。C2-乙炔基-NAD⁺（3）可被PARP1、PARP2和tankyrases接受；N6-炔丙基-NAD⁺（4）用于富集候选PARP1底物；C8-(炔丙基氨基)类似物（5）是较差的底物，其PARP1催化效率为0.51 M^?1 s^?1，而4为5.0 × 10³ M^?1 s^?1。烟酰胺-核糖3′-叠氮NAD⁺可被PARP1和PARP2高效利用并生成对PARG水解具有增强抗性的PAR产物。ADO-4′-N3-NAD⁺（7）具有更广泛的ART兼容性，涵盖PARP1、PARP2、tankyrases及PARP10等单ART。双功能探针（8和9）结合富集手柄与光活化交联剂，实现PAR依赖性相互作用蛋白的捕获。

4.2 用于归属writer酶的化学遗传学探针

化学遗传学策略将工程化ART/PARP活性位点与空间匹配的NAD⁺类似物配对，创建正交writer-探针对。化合物10结合烟酰胺C5位bulky取代基与N6连接炔烃，化合物11携带C8-丁炔基取代基，用于writer分辨的底物和修饰位点图谱分析。5-苄基-2-乙炔基-NAD⁺（12）与I631G PARP7变体配对，在HEK293T裂解液中鉴定出250个直接PARP7靶标，将半胱氨酸MARylation与免疫相关蛋白联系起来。

4.3 用于测试PAR结构的链终止探针

PAR延伸需要核糖羟基形成核糖-核糖糖苷键，因此2′-或3′-修饰的NAD⁺类似物可允许初始ADP-核糖转移同时限制后续聚合物延伸。脱氧系列（13）结合腺苷2′-OH、3′-OH或两者的去除与腺嘌呤连接炔烃，可分离起始与延伸步骤并简化PAR产物。

4.4 用于时空ADP-核糖基化的可视化探针

荧光C2修饰NAD⁺类似物，包括C2-TMR-NAD⁺（14），已用于蛋白质聚ADP-核糖基化的实时细胞成像，结合荧光寿命或FRET读数可提供PAR合成和PAR相关蛋白相互作用的信息。C2-desthiobiotin-NAD⁺（15）提供亲和手柄，胆固醇和R8K偶联TMR类似物（16）添加促进递送的取代基以改善细胞内可及性。

4.5 稳定辅因子模拟物和氨基取代类似物

4′-硫代核糖NAD⁺（17）保留氧化还原辅因子活性但抵抗人CD38和SIRT2的切割。化合物18结合烟酰胺连接核糖上的氨基取代与腺苷核糖上的叠氮取代，相关氨基取代类似物为糖立体化学和辅底物识别提供机制比较。

5. 探针驱动的机制应用

5.1 ADP-核糖基化网络的蛋白质组学图谱

蛋白质组学工作流程利用富集从复杂样品中回收低丰度ADP-核糖基化物种。可点击和亲和标记的NAD⁺类似物在PARP催化过程中安装化学可处理手柄，标记蛋白可通过荧光检测、免疫印迹、亲和纯化或LC-MS/MS蛋白质组学分析。探针辅助工作流程已在DNA损伤、氧化应激和炎症刺激背景下检测ADP-核糖基化，揭示其不仅限于经典DNA修复因子，还涉及转录、RNA代谢、蛋白质质量控制、染色质组织、应激反应和信号转导。然而，蛋白质组学富集应被解释为发现而非证明，标记蛋白可能是直接底物、邻近相互作用物、通过非共价关联捕获的reader或应激诱导组装体的组分。

5.2 Reader发现与ADP-核糖依赖性相互作用

NAD⁺衍生和ADP-核糖基探针通过呈现明确的ADP-核糖结构作为生化诱饵，实现了ADP-核糖reader蛋白的亲和发现。光可点击、链终止NAD⁺类似物PCCT-NAD⁺通过生成末端功能化PAR，实现了氧化应激下PAR相互作用蛋白的珠固定光交联图谱分析。定量平台如PAQMAN将探针定义的结构与表观结合亲和力和选择性联系起来。蛋白质组学研究已鉴定经典PAR结合模块以及FHA、BRCT、OB-fold、锌指、RNA识别、WD40和富含碱性残基蛋白作为潜在ADP-核糖相关因子，表明ADP-核糖识别存在于一个谱系而非简单的结合/非结合分类。