基于丁二酸巯基酸（DMSA）单酯与单酰胺的模块化合成及其在逆转肺癌金属诱导化疗耐药中的应用研究

《RSC Medicinal Chemistry》：Dimercaptosuccinic acid (DMSA) mono-esters and amides: synthesis and application in treating metal induced drug resistance in lung cancerOpen Access

　　

摘要专业翻译 丁二酸巯基酸（DMSA）单酯已被证明是能够在多种生物应用中去除重金属的高效螯合剂。尽管该类螯合剂在急性重金属中毒中的效用已被广泛报道，但获得多种衍生物的能力一直是一个合成挑战，往往依赖于由化学计量控制的统计混合物。在本报告中，研究人员详述了一种以市售乙炔二羧酸为起始原料的稳健四步合成路线，该路线可同时生成丁二酸巯基酸单酯和单酰胺。研究人员测试了这些化合物在肺癌细胞中逆转过渡金属诱导的化疗耐药的能力。与先前聚焦于单一丁二酸巯基酯（MiADMSA）的研究类似，所生成的许多类似物均能够引起对阿霉素（doxorubicin）的增敏作用，显著降低其IC50值。本报告证明，用于生成DMSA衍生物的增强合成路线能够快速获得新型螯合剂，其在恢复化疗敏感性方面与先前化合物相当或更有效。此外，该路线的模块化特性允许简单替换构建模块，从而能够快速评估化学空间。

论文解读文章

研究背景与问题

重金属螯合剂在医学和环境治理领域有着悠久且成熟的应用历史。过渡金属在体内或环境中的过量存在可导致毒性效应，因此开发能够高效结合并去除这些金属离子的化合物至关重要。在众多螯合剂中，二巯基类化合物（di-mercaptans）是公认的重要类别，代表性药物包括二巯丙醇（BAL）、2,3-二巯基-1-丙磺酸（DMPS）和丁二酸巯基酸（DMSA），这些化合物已在临床中用于多种疾病的治疗。然而，现有螯合剂仍面临膜通透性不足、稳定性有限、结合亲和力有待提高以及治疗窗口需扩大等挑战。

为解决上述问题，研究人员此前开发了含有单酯官能团的DMSA新类似物以增加亲脂性，其中最广泛研究的类似物是单异戊基DMSA（MiADMSA），其已被证明在从细胞内去除有毒金属离子方面优于未修饰的DMSA。然而，先前由Jones等人建立的合成方法采用DMSA在酸性条件下的化学计量酯化，该方法可能导致不期望的二酯副产物生成，使纯化过程复杂化并降低总产率。此外，该方法需要使用后期立体定义的起始原料，使得路线成本过高，尤其不利于放大生产。因此，开发一种能够快速、模块化生成多种立体定义的DMSA类似物的通用合成策略是该领域亟待解决的关键问题。

研究内容与意义

研究人员利用其先前在酯化和酰胺化方法学方面的积累，探索了一种以非立体中心起始原料生成的环状合成中间体为关键步骤的通用方法。该方法此前仅在少数选定实例或固相应用中得到展示。研究人员假设利用环状中间体的策略能够避免不期望的二取代产物生成，从而实现快速化合物库构建。该研究的意义在于提供了一条灵活、模块化的合成路径，能够快速生成多种DMSA单酯和单酰胺类似物，这些化合物在恢复化疗敏感性方面具有与先前化合物相当或更优的效果，为金属相关疾病和化疗耐药癌症的治疗提供了新的候选化合物。

关键技术与方法

研究人员开发了一条以市售乙炔二羧酸（化合物1）为起始原料的四步合成路线。首先，通过硫代乙酸（thioacetic acid）对炔烃进行加成，生成双硫酯中间体（化合物2），该步骤可成功放大至50克规模。随后，将化合物2悬浮于乙酰氯中于50°C反应，以定量产率生成环状琥珀酸酐中间体（化合物3），该步骤中meso-型异构体被高度优先形成。关键的开环步骤中，化合物3在甲苯中于40°C与异戊醇反应，选择性生成单一单酯产物（化合物4a），产率82%，非对映体比率（dr）为79:21。最后，通过巯基乙酸在PBS缓冲液/甲醇溶液中进行脱保护，得到最终产物（化合物5a），仅分离出anti-立体异构体，产率70%。研究过程中通过单晶X射线衍射确认了各中间体和最终产物的连接方式和立体化学。此外，研究人员利用该路线探索了多种氧和氮亲核试剂的开环反应范围，并选取部分化合物进行最终脱保护反应。在生物学评估中，研究人员在Beas-2B细胞系中进行了体外研究，使用由铜、锌、锰、镉、铬和铅盐组成的金属混合物溶液模拟与癌症相关的过渡金属环境，通过细胞活力测定评估各类似物对阿霉素（doxorubicin）增敏效果。对表现最佳的化合物5j，研究人员进一步通过紫外-可见光谱滴定（UV-vis titration）研究了其与不同二价金属离子的结合行为，并使用Bindfit软件（L-BFGS-B算法）拟合逐步结合常数。此外，利用ChemAxon开发的Chemicalize平台计算了化合物的log P和log D_7.4值以评估亲脂性。

研究结果

合成路线的建立与验证。 研究人员成功建立了以环状琥珀酸酐3为关键中间体的四步合成路线，并以此合成了已知螯合剂MiADMSA（5a）。通过单晶X射线衍射确认了化合物2、3、4a和5a的晶体结构，最终产物5a经NMR检测未发现syn-异构体，确认了anti-立体构型的专一性。

亲核开环反应范围探索。 研究人员测试了多种氧和氮亲核试剂对中间体3的开环反应。脂肪族伯醇（甲醇、乙醇、异丙醇）均能有效开环，分别以86%、53%和74%的产率生成化合物4b、4c和4d。含有Csp2、Csp和仲醇官能团的醇类也能被兼容。苄醇类化合物无论带有供电子基团（Me、OMe）还是吸电子基团（F、NO₂、CF₃）均能以中等至良好产率生成产物（4h–4n）。苯胺可以35%的产率生成化合物4o，但酚类亲核试剂未能成功开环。苄胺和对甲氧基苄胺分别以46%和68%的产率生成酰胺产物4p和4q。含苯并噻唑的苯胺亲核试剂也成功反应，以57%产率生成化合物4r。

最终脱保护反应范围。 研究人员选取部分酰基保护化合物进行脱保护反应。所有酯类化合物均能成功脱保护，其中含芳基的衍生物产率最高，如甲苯基衍生物5i产率为64%。脂肪族链的脱保护产率较低，甲基（5b）和乙基（5c）化合物产率较低，而异丙基（5d）产率较高达47%。值得注意的是，酰胺类衍生物脱保护后得到的产物为syn和anti-非对映异构体的混合物，而酯类衍生物在所有情况下均仅分离出anti-异构体。所有测试的酰胺均以中等产率获得，其中化合物5q脱保护效率最高，产率49%。

细胞增敏活性评估。 研究人员在Beas-2B细胞中评估了12种DMSA类似物逆转金属诱导的化疗耐药能力。细胞活力测定显示，除化合物5p外，DMSA类似物和金属混合物在无化疗药物存在时对细胞活力无显著影响。在金属负载环境中，阿霉素的疗效显著降低，而MiADMSA（5a）能有效恢复细胞对阿霉素的敏感性。在所测试的12种化合物中，9种显示出显著的增敏作用。表现最佳的三个类似物为对甲氧基苄酯5j、乙酯5c和对甲氧基苄酰胺5q。研究人员还排除了阿霉素自身作为螯合剂的可能性，通过金属含量测量和MRE报告基因检测确认阿霉素不会显著改变细胞内金属水平。初步构效关系（SAR）分析显示，脂肪族酯类整体表现较差，而含芳香环的酯类均产生统计学显著的IC₅₀降低；对位取代基耐受良好，间位取代基表现较差；对位供电子基团可能有利于活性提升。

金属结合能力研究。 研究人员对表现最佳的化合物5j进行了紫外-可见光谱滴定研究。在与Pb²⁺和Cd²⁺滴定中，观察到250–320 nm范围内的显著光谱变化，表明这些软/边界软金属离子与含硫醇配体发生了配位。通过拟合2:1（配体:金属）模型，获得PbL₂和CdL₂的逐步稳定常数分别为log β = 8.76和8.93。与Cu²⁺滴定中，在约385 nm处立即出现新的吸收带，这是硫醇盐–Cu²⁺配体到金属电荷转移（LMCT）跃迁的特征，但该体系表现出显著的动力学不稳定性，无法用简单平衡模型描述。与Mn²⁺滴定仅观察到微小光谱变化，与Zn²⁺滴定产生的变化不足以提取结合常数。结合亲和力趋势（Cd²⁺ ～ Pb²⁺ ? Zn²⁺ > Mn²⁺）与硬软酸碱（HSAB）理论对硫供体配位的预测一致。

亲脂性计算。 研究人员计算了最佳三个类似物（5c、5j、5q）的log P和log D_7.4值，并与DMSA和BAL进行比较。所有最佳化合物的log D_7.4值均显著高于DMSA（?5.413），分别为?3.375（5c）、?2.528（5j）和?2.316（5q），表明单酯或单酰胺的引入大大增加了亲脂性，从而提高了细胞膜通透性。

结论

传统DMSA类似物的生成方法依赖于统计混合物或仅在选定实例中得到验证。本研究证明，以关键琥珀酸酐3为中间体是一条简便且高度灵活的合成路线，能够快速生成此类分子的化合物库。虽然部分亲核试剂（如酚类）不兼容，但绝大多数测试的亲核试剂均能有效反应。最终脱保护步骤也能在多种电子性质不同的化合物中顺利进行。值得注意的是，当存在酯基时，最终步骤中可完全控制分离的立体异构体，仅获得anti-构型；而对于酰胺类化合物，则观察到异构体混合物。研究人员认为该路线提供了一条灵活、模块化的快速化合物生成途径，鉴于此类分子在临床中的良好记录，这一点尤为重要。通过新化合物库的构建，研究人员证明这些化合物能显著影响金属负载Beas-2B细胞中阿霉素的IC₅₀值，表明该类化合物在恢复受高浓度环境过渡金属影响的癌细胞化疗敏感性方面具有应用前景。其中，对甲氧基苄酯5j被确定为效果最佳的化合物。紫外-可见滴定研究和亲脂性计算表明，此类化合物在跨多种金属的有效螯合能力与合适的亲脂性特征之间取得了平衡，能够进行细胞内螯合。研究人员认为这些化合物与现有化疗药物具有互补性，为耐药病例和未来可能与金属负载相关的其他疾病提供了新的治疗途径。