南非植物 Pelargonium citronellum 与 Hypoestes forskaolii 的抗分枝杆菌和抗生物膜活性及草药-药物相互作用与 MTR/GTR 抑制机制研究

《South African Journal of Botany》：Antimycobacterial and antibiofilm studies on selected South African plants

　　

•结核病（tuberculosis, TB）是一种全球性细菌传染病，具有高流行率和高死亡率。
•Pelargonium citronellum 和 Hypoestes forskaolii 是有前景的南非抗结核（anti-tuberculosis, anti-TB）植物，分别对 Mycobacterium tuberculosis 具有最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为 65 μg/mL 的显著抗生物膜活性，并对 M. smegmatis mc²155 具有半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）为 74.46 μg/mL。
•Ciprofloxacin 与 P. citronellum 的乙醇（ethanol, EtOH）提取物共给药时，表现出分数抑制浓度（fractional inhibitory concentration, FIC）为5，表明体外存在拮抗性草药-药物相互作用。
•P. citronellum 的 EtOH 提取物在体外抑制分枝杆菌硫醇还原酶（mycothiol reductase, MTR）的活性，浓度为 0.01 μg/mL（米氏常数（Michaelis constant, K_m）=0.73 μM；最大反应速率（maximum velocity, V_max）=1.18 μM），并抑制谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GTR）在 0.55 μg/mL（K_m=3.97 μM；V_max=96.3 μM）。

研究背景与问题
结核病（tuberculosis, TB）由 Mycobacterium tuberculosis 引起，是全球单一感染原所致死亡的首位原因，每年约1000万例感染和约160万死亡。发展中国家负担尤其严重，并受 HIV 合并感染和多药耐药结核病（multidrug-resistant TB）传播影响。标准结核化疗虽然有效，但疗程长、副作用大、总体费用高且耐药不断出现。因此天然产物作为补充治疗受到关注。南非民族植物学资源丰富，许多传统用于治疗结核相关症状的植物尚未得到充分药理评价。与此同时，草药-药物相互作用是重要隐患，可能造成药代或药效学相互作用，导致肝毒性或治疗失败。基于此，研究人员选择11种具有民族药用相关性的南非植物，评价其抗分枝杆菌和抗生物膜活性，并评估有前景提取物的潜在草药-药物相互作用，以寻找适合补充结核治疗的抗分枝杆菌候选物。
关键技术方法
研究人员采用体外 Presto Blue 法检测11种植物二氯甲烷（dichloromethane, DCM）、乙醇（ethanol, EtOH）、水（H₂O）提取物对 M. smegmatis mc²155（ATCC 700084）和 M. tuberculosis H37Rv（ATCC 25618）的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）与 IC₅₀；用微孔板结晶紫法测最低生物膜抑制浓度（minimum biofilm inhibitory concentration, MBIC）与 IC₅₀；以 HepG2 细胞评估抗增殖，并用对乙酰氨基酚（acetaminophen）诱导评估肝保护。对活性提取物与 bedaquiline、ciprofloxacin、rifampicin 采用连续稀释法和棋盘法测分数抑制浓度（fractional inhibitory concentration, FIC）。进行 MTR 和 GTR 酶抑制与动力学分析；用 SWISS-MODEL 同源建模，Maestro/Glide XP 对 nerol、geraniol、trans-geranic acid 与 MTR、GTR 分子对接。植物采自 University of Pretoria Manie van der Schiff Botanical Gardens，凭证存于 H.G.W.J. Schweickerdt Herbarium；菌株由 MRC 提供，HepG2 由 University of Pretoria 提供。
研究结果
3.1 抗分枝杆菌活性（Antimycobacterial activity）
通过 Presto Blue 法检测，11种植物提取物中对 M. smegmatis mc²155 和 M. tuberculosis H37Rv 的活性以 P. citronellum 和 H. forskaolii 较突出。P. citronellum 的 DCM 提取物对 M. smegmatis mc²155 的 IC₅₀ 为 353.4 ± 0.3 μg/mL，EtOH 提取物对 M. tuberculosis H37Rv 的 MIC 为 500 μg/mL；H. forskaolii 的 EtOH 提取物对 M. smegmatis mc²155 的 IC₅₀ 为 470.6 ± 2.4 μg/mL，对 M. tuberculosis H37Rv 的 MIC 为 500 μg/mL。其他提取物活性弱或无，均弱于 ciprofloxacin、isoniazid 和 rifampicin 阳性对照。研究人员据此选择 P. citronellum 和 H. forskaolii 进一步研究。
3.2 抗生物膜活性（Antibiofilm activity）
通过微孔板结晶紫抗生物膜法，H. forskaolii 的 DCM 和 EtOH 提取物显示领先抗生物膜活性：DCM 提取物对 M. tuberculosis H37Rv 的 MBIC 为 62.5 μg/mL，EtOH 提取物对 M. smegmatis mc²155 的 IC₅₀ 为 74.5 ± 0.3 μg/mL。P. citronellum 的 DCM 提取物 MBIC 为 206 ± 0.26 μg/mL。各植物活性仍弱于阳性对照，但其抗生物膜作用支持进一步机制研究。
3.3 抗增殖与肝保护活性（Antiproliferative and hepatoprotective activity）
研究人员用 HepG2 细胞评估肝毒性。H. forskaolii 和 P. citronellum 的 DCM、EtOH 提取物均显示肝毒性，IC₅₀ 介于 14.71 与 46.43 μg/mL 之间。25 mM acetaminophen 使 HepG2 细胞活力降低50%。在 acetaminophen 暴露下，测试植物提取物肝保护活性很小；silymarin 仅提供轻微保护，单独 silymarin 轻微增加 HepG2 细胞增殖。植物提取物与 acetaminophen 之间未见显著拮抗。结论是两植物细胞毒性明显，肝保护作用弱。
3.4 选择性指数（Selectivity index）
通过 IC₅₀(HepG2)/MIC 或 MBIC 计算选择性指数（selectivity index, SI）。除 H. forskaolii 的 EtOH 提取物相对 M. smegmatis mc²155 抗分枝杆菌活性 SI 值为2、呈中等选择性外，其余提取物 SI 值≤1.0。提示总体选择性低，可能对病原体和宿主细胞均有影响。
3.5 联合研究（Combination studies）
通过连续稀释法和棋盘法评估植物提取物与抗生素联用。P. citronellum 的 EtOH 提取物和 H. forskaolii 的 DCM 提取物对 bedaquiline 和 rifampicin 活性无实质影响。Ciprofloxacin 与 H. forskaolii 的 DCM 提取物在比例3:7、4:6、5:5 时显示协同；而与 P. citronellum 的 EtOH 提取物在比例1:9、2:8、3:7 时显示拮抗。说明体外存在草药-药物相互作用。
3.6 分枝杆菌硫醇还原酶与谷胱甘肽还原酶（Mycothiol and glutathione reductase）
通过酶抑制与动力学实验，P. citronellum 的 EtOH 提取物抑制分枝杆菌硫醇还原酶（mycothiol reductase, MTR），浓度为 0.01 μg/mL，K_m=0.73 μM，V_max=1.18 μM；抑制谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GTR），浓度为 0.55 μg/mL，K_m=3.97 μM，V_max=96.3 μM。其他提取物未显示相应抑制。提示该提取物可能干扰分枝杆菌抗氧化防御，但同时影响人同源酶并不理想。
3.7 谷胱甘肽还原酶与分枝杆菌硫醇还原酶模型的验证（Validation of the glutathione reductase and mycothione reductase models）
由于 P. citronellum 抑制 MTR 和 GTR，研究人员进一步研究其主要成分与两酶结合。同源建模显示，GTR 与 Thermus thermophilus 二氢硫辛酰脱氢酶序列同一性为48.7%，活性位点氨基酸保守；MTR 与 M. tuberculosis 氧化还原酶序列同一性为98.4%。GTR 有92.5%残基位于最 favored 区，全局模型质量估计（global model quality estimation, GMQE）为0.75；MTR 有91.8%残基位于最 favored 区，GMQE 为0.69。模型质量支持后续分子对接。
3.8 对谷胱甘肽还原酶的分子对接（Molecular docking to glutathione reductase）
通过分子对接，P. citronellum 中 nerol、geraniol 和 trans-geranic acid 与 GTR 的结合被分析。trans-geranic acid 通过直接和水介导氢键与 GTR 结合，HOH 1483 将羧基连接至 Gly148 和 Ile312，HOH 1485 将羰基连接至 Ala146 和 Gly18，对接能为?4.8 kcal/mol。Geraniol 显示一个水介导氢键 HOH 1483 与 Gly148 和 Ile312，并有较多疏水作用，对接能?4.2 kcal/mol。Nerol 也显示一个水介导氢键 HOH 1483 与 Gly148 和 Ile312，并与 Ile53、Val50、Leu48 形成疏水作用，对接能?3.7 kcal/mol。结合腔高度疏水，疏水作用对结合识别重要，整体结合较弱。
3.9 对分枝杆菌硫醇还原酶结合物的分子对接研究（Molecular docking studies for mycothiol reductase binders）
通过分子对接，nerol 的羟基与 Arg97 形成氢键，并与 Ala154 至 Phe157、Phe95 等疏水残基作用，结合能?2.6 kcal/mol。Geraniol 有一个水分子靠近其羟基，但不与周围活性位点残基作用，并与 Pro101、Phe99、Ile161 形成疏水作用，结合能?2.6 kcal/mol。trans-geranic acid 由三个水分子 HOH530、HOH413、HOH536 介导氢键与 Ala154 结合，结合能?2.0 kcal/mol。结果表明主要单萜类成分可与 MTR 活性位点发生相互作用，水介导氢键网络和疏水作用较突出。
讨论
讨论指出，通常抗结核天然产物提取物 MIC 和 MBIC 低于100 μg/mL 视为有前景，100–625 μg/mL 为中等活性，大于625 μg/mL 为弱活性。本研究中提取物抗分枝杆菌作用弱，但 H. forskaolii 和 P. citronellum 的抗生物膜活性有前景，因此被选为后续研究对象。根据美国国家癌症研究所植物筛选程序标准，粗提物体外细胞毒性以 CC₅₀<30 μg/mL 判断，而肝保护需使 acetaminophen 暴露后的 HepG2 细胞活力恢复至少50%。本研究中两植物肝毒性明显、肝保护弱、选择性低，提示可能存在广谱代谢毒性。联合研究中 ciprofloxacin 与 P. citronellum 的 EtOH 提取物发生拮抗，可能降低抗生素疗效并导致治疗失败，支持耐药风险。MTR 抑制可能破坏分枝杆菌抗氧化防御，阻碍其存活和生长，是潜在治疗方向；但抑制人同源 GTR 不理想，因为还原型谷胱甘肽减少可增加氧化应激、损害解毒和免疫功能，并支持神经退行性疾病和癌症形成。P. citronellum 富含亲脂性单萜 nerol、geraniol 及其氧化衍生物 trans-geranic acid，这些成分适合破坏细菌细胞膜。分子对接显示它们与 MTR、GTR 有相互作用，但结合得分较低，nerol 和 geraniol 以疏水作用为主，trans-geranic acid 出现水分子桥接氢键。
研究结论翻译
在本研究中，研究人员通过测定抗分枝杆菌和抗生物膜活性，研究了11种南非药用植物的抗结核潜力。P. citronellum 和 H. forskaolii 的提取物是有前景的植物。H. forskaolii 的 DCM 和 EtOH 提取物表现出领先的抗生物膜活性，其次为 P. citronellum 的 DCM 提取物。联合研究揭示 P. citronellum 的 EtOH 提取物与 ciprofloxacin 标准药物之间存在拮抗性草药-药物相互作用，这可能提示联合治疗中抗生素有效性可能降低。此外，这些提取物对人肝细胞显示出比抗生物膜活性更高的细胞毒性，且没有实质水平的肝保护。基于机制研究，P. citronellum 的 EtOH 提取物对分枝杆菌的 MTR 和 GTR 蛋白表现出显著抑制。最后，计算机研究显示结核蛋白 MTR 和 GTR 与 P. citronellum 的主要单萜类化合物 nerol、geraniol 和 trans-geranic acid 之间具有强结合亲和力。虽然本研究认为 P. citronellum 和 H. forskaolii 可能具有某些抗结核特性，但可能需要对这些植物进行广泛的植物化学、体内药理学和毒理学研究，以充分阐明其抗结核潜力。