神经元来源囊泡化circMagi1经TRIM65介导ANXA2降解抑制缺血性脑卒中后血管修复

《Advanced Science》：Neuron-Derived Vesicular circMagi1 Restrains Vascular Repair After Ischemic Stroke by Promoting TRIM65-Mediated ANXA2 Degradation

　　

循环RNA(circRNA)参与脑卒中发病，但其在缺血神经血管单元内的细胞间功能尚不清楚。研究人员对血浆细胞外囊泡(EV)进行测序分析，发现急性缺血性脑卒中患者血浆EV中circMagi1丰度高于健康对照；缺血小鼠脑内亦见上调，细胞类型解析显示受损神经元是含circMagi1的EV主要来源，这些EV在 endothelial cells(内皮细胞, EC)中聚集。机制上，内皮细胞circMagi1结合ANXA2并增强其与TRIM65 engagement(结合/募集)，促进TRIM65介导的ANXA2 ubiquitination(泛素化)及 proteasomal degradation(蛋白酶体降解)，抑制 angiogenesis(血管生成)。治疗中，post-stroke day 1起用siCircMagi1-RVG-EV持续抑制circMagi1，siTrim65-Ang2-EV自day 1或day 9加入；在所试方案中，day 9再加siTrim65-Ang2-EV比单用早期circMagi1靶向或day 1同步联合更易伴发更优神经血管恢复。上述结果阐明一条囊泡介导的“神经元损伤→内皮修复受抑”信号轴，并支持在持续circMagi1抑制背景下进一步评估延迟TRIM65抑制。

研究背景方面，缺血性脑卒中是全球长期致残主要病因，大动脉再通后仍可出现“no-reflow(无复流)”与微循环衰竭，说明功能恢复受神经血管单元(neurovascular unit, NVU)再生能力限制。circRNA因共价闭合结构稳定，可被EV选择性包装并在细胞间传递；但哪些致病circRNA劫持内皮蛋白降解机器、抑制血管生成仍属知识空白。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)与时空病理演变又使CNS内RNA靶向治疗转化困难。该论文发表于《Advanced Science》，研究人员据此提出并验证一条神经元来源EV包装circMagi1、转运至内皮细胞、经TRIM65-ANXA2轴抑制血管修复的机制，并比较早期与延迟TRIM65抑制的治疗时序价值。

主要关键技术方法包括：临床端纳入急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke, AIS)患者与健康对照(healthy control, HC)血浆EV队列，小鼠端采用middle cerebral artery occlusion(MCAO, 大脑中动脉闭塞)模型；EV经密度梯度超离纯化与rRNA去除、RNase R消化后做circRNA测序；体内用AAV-shRNA、RVG-Lamp2b EV与Angiopep-2(Ang2) EV递送核酸；机制端用RNA antisense purification(RAP, RNA反义纯化)偶联质谱、RNA immunoprecipitation(RIP)、electrophoretic mobility shift assay(EMSA, 电泳迁移率变动分析)、cycloheximide(CHX)追踪、体外泛素化重组体系；单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)用于解析缺血脑组织细胞格局；行为学、MRI、TTC染色用于体内表型。

研究结果如下。2.1 CircMagi1 is Elevated in Circulating EVs During Acute Ischemic Stroke and Induced in Ischemic Brain Tissue：研究人员通过血浆EV circRNA测序与跨物种验证，发现circMagi1在AIS患者和小鼠MCAO中一致上调，其水平与MRI定义缺血灶负荷线性相关，day1至day7升高，ROC显示较好鉴别效能，故将其定为卒中响应型EV包装circRNA生物标志物候选。2.2 AAV-Mediated circMagi1 Silencing Reduces Ischemic Injury and Improves Neurological Recovery：术前AAV-shCircMagi1脑室注射使MCAO后24小时梗死缩小，day50残灶减少、血浆EV circMagi1下降，pole test、modified neurological severity score(mNSS)、rotarod显示感觉运动恢复改善，且线性Magi1转录本不受影响，证明靶向back-splice junction(反向剪接接头)具特异性。2.3 RVG-EV-Mediated circMagi1 Silencing Promotes Microvascular Remodeling and Functional Recovery：尾静脉给siCircMagi1-RVG-EV自day1起每4天一次，可入脑、降内源circMagi1约80%，缩小梗死并改善grid-walking、cylinder、pole、adhesive removal；scRNA-seq显示内皮细胞与神经元池保留增加，内皮差异基因富集血管再生，pseudotime分析见Vegfa^low向Vegfa^high转化及促血管生成模块上调。2.4 Injured Neurons Supply circMagi1-Containing EVs to Endothelial Cells After Ischemic Stroke：免疫磁珠分选显示神经元circMagi1在MCAO后6小时即升、内皮迟发升高；原代神经元OGD/R可自主诱导circMagi1，内皮单培养不显，transwell共培养时内皮积累依赖EV释放，GW4869阻断中性鞘磷脂酶依赖EV分泌可减内皮积累；体内AAV-hSyn-CD63-mCherry神经元EV报告、酸洗实验与FISH共定位支持神经元→内皮囊泡转移。hSyn驱动沉默优于Icam2内皮驱动沉默，说明神经元源信号是上游主因。2.5 CircMagi1 Binds ANXA2 and Suppresses Endothelial Angiogenic Function：RAP-MS将ANXA2定为关键互作蛋白；AlphaFold预测G265-U271为优势界面，位点突变Mut B失效；EMSA、RIP证实直接结合；过表达WT circMagi1降ANXA2蛋白并损tube formation与transwell invasion，突变体不抑制，证明circMagi1作为ANXA2配体发挥内皮致病效应。2.6 circMagi1 Promotes TRIM65-Mediated ANXA2 Ubiquitination by Enhancing ANXA2-TRIM65 Engagement：CHX追踪加MG132、chloroquine(CQ)、bafilomycin A1(BafA1)处理表明ANXA2丢失主要靠ubiquitin-proteasome system(UPS, 泛素-蛋白酶体系统)而非自噬/溶酶体；Co-IP、RNase救援、纯化成系实验显示intact circMagi1通过RNA-dependent proximity effect(RNA依赖的邻近效应)增强基础ANXA2-TRIM65结合；无细胞体系用E1/E2/TRIM65/ATP/HA-K48-only ubiquitin证明WT circMagi1促ANXA2 ubiquitination，siTRIM65回补可恢复ANXA2与成管/侵袭功能。2.7 Delayed Addition of TRIM65 Inhibition is Associated With Greater Recovery During Sustained circMagi1 Suppression：RVG-EV持续抑circMagi1背景下，Ang2-EV递siTrim65自day1(C组)或day9(D组)加药；D组较B组残行为分数更低，较C组mNSS、前肢不对称、foot-fault更优，peri-infarct区ANXA2与CD31更高、TRIM65与IBA1/CD68更低，day28血浆IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-β、C3a、C5a更低，支持亚急性期延迟抑TRIM65利于血管重塑与神经炎症下行。

讨论部分总结：研究人员强调该轴是生理神经血管耦合在缺血后的maladaptive inversion(适应不良性反转)；选back-splice junction而非共享线性区作靶点可保Magi1生理功能。文中坦承未做内源circMagi1单分子实时追踪，结论来自细胞类型动态、EV释放阻断、神经元EV报告与酸洗抗性信号的会聚证据。RVG与Ang2 EV并非绝对细胞特异，而是compartment-biased(区室偏倚)递送。时序上day9优于day1可能与亚急期血管重塑窗口有关，但两组给药次数不同，不能严格分离时间效应与累积剂量效应。血浆EV circMagi1具生物监测潜力，但需大队列、多时间点、异质子型验证。局限还包括雄性小鼠、lissencephalic(平滑脑)鼠脑、缺女性与老龄/合并症模型、pericyte(周细胞)与microglia(小胶质细胞)贡献未全明，TRIM65涉RIG-I先天免疫故联合抑制需安全评估。

研究结论部分翻译：恢复微血管灌注是缺血性脑卒中后功能恢复的先决条件，但抑制血管修复的分子信号仍未完全阐明。本研究确定一条致病性神经元到内皮信号轴：受损神经元将EV包装的circMagi1供给内皮细胞，从而对血管生成恢复施加翻译后刹车；该轴通过TRIM65介导的ANXA2降解把神经元损伤与内皮功能障碍相连，揭示缺血NVU主动抑制自身再生能力的机制。治疗实验进一步提示，在持续circMagi1抑制背景下，下游TRIM65抑制的效应随给药时序而变化，凸显该轴可作为缺血性脑卒中后血管修复的候选靶点。