Jatropha dioica 提取物用于牙周辅助治疗的抗菌活性及其对人牙龈成纤维细胞的细胞毒性评价

《Revista Argentina de Microbiología》：Antibacterial and cytotoxic evaluation of Jatropha dioica extract for periodontal coadjutant treatment

　　

目前，关于 J. dioica 抗菌和细胞毒性特性的报道有限。为 J. dioica 植物疗法（phytotherapy）的使用提供科学支持，符合全球人群利益。在低收入农村社区，植物疗法（phytotherapy）是牙周炎（periodontitis）治疗的一种选择。

牙周病（periodontal disease）仍是全球重要健康问题。Tannerella forsythia（T. forsythia，一种与牙周炎相关的厌氧菌）可与 Porphyromonas gingivalis、Treponema denticola 构成 Socransky 等提出的红色复合体（red complex，由三种牙周病原菌组成的复合体），常见于成人牙周炎，并适合在牙周袋厌氧环境中繁殖，参与破坏牙周组织。T. forsythia 通常对机械治疗反应良好，但若治疗后仍以较高比例存在，提示牙周预后较差；其存在还与动脉粥样硬化、类风湿关节炎、2型糖尿病及某些类型癌症风险增加相关。因此，降低其水平尤其重要，尤其在计划牙周手术时。Filifactor alocis（F. alocis，革兰阳性厌氧菌）在牙周袋中高发，也见于根尖病损根管和种植体周围炎，是与多种口腔感染相关的少数微生物之一。尽管牙周炎患者抗生素耐药尚未达到临界水平，仍需合理抗生素管理、准确牙周诊断、医患教育及天然辅助治疗开发。墨西哥农村人群常用植物提取物治疗口腔疾病。Jatropha dioica（J. dioica，墨西哥干旱和半干旱地区多年生灌木）传统用于癌症和口腔疾病，可促进伤口愈合，也用作红色染料。其酚类化合物具抗氧化和抗菌活性，精油中萜类和生物碱也显示抗菌作用。低中收入人群牙周治疗可及性有限，传统植物疗法包括咀嚼 J. dioica 根茎。J. dioica 含有 citlalitrione、jatrophatrinone、jatropholones A 和 B、riolozatrione、6-epi-riolozaone、二萜、β-sitosterol、ellagic acid 等。其根茎水醇提取物对 Streptococcus mutans 有抗菌活性。体外研究显示其对 NIH/3T3 小鼠成纤维细胞和 LLC-PK1 猪肾上皮细胞低细胞毒性；动物研究中孕鼠及新生儿经胎盘暴露未见细胞毒性。尽管如此，作为牙周感染辅助治疗，仍需进一步研究其毒性和药理特性。因此，研究人员旨在评价 J. dioica 提取物的抗菌特性和细胞毒性，以支持其在牙周感染管理中的应用。

方法概括：研究人员使用由 Terrazas et al. 提供并保存于 ?70 °C 的 J. dioica 根茎，注册码为 “AD Hernández Fuentes 01”，经冻干、蒸馏水重悬至 30 mg/ml、超声并灭菌。抗菌实验采用美国典型培养物保藏中心（ATCC）的 T. forsythia（ATCC: 43037）和 F. alocis（ATCC: 35896），用微肉汤稀释法，提取物浓度为 5、15、30、300 μg/ml，厌氧 72 h，测 OD₅₉₅，以环丙沙星（ciprofloxacin）为阳性对照，确定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。细胞实验采用 ATCC 人原代牙龈成纤维细胞（human primary gingival fibroblasts，HGF，PCS-201-018），以 1.5 × 10⁴ cells/cm² 接种，处理 1、3、5、7 天，用刃天青（resazurin）法测 OD₅₇₀。统计使用 Student's T 检验、单因素方差分析（ANOVA）及 Tukey 事后检验。

研究结果：在“J. dioica 提取物的微生物敏感性检测（Microbial susceptibility testing of J. dioica extract）”中，研究人员通过微量肉汤稀释和 OD₅₉₅ 测定显示，对 T. forsythia，MIC 为 5 μg/ml，产生 80% 抑制，与阳性对照有显著差异（p < 0.01）；15、30、300 μg/ml 分别使细菌活力降低 69%、61%、34%，各剂量均显著。对 F. alocis，各浓度与阳性对照无显著差异；最低剂量 5 μg/ml 获得最高抑制 58%，被定为 MIC。最显著发现是最高抗菌效果出现在最低浓度 5 μg/ml。所有受试剂量对 T. forsythia 的抑制均优于对 F. alocis；两个最低剂量超过环丙沙星对两种细菌的抑制，环丙沙星对 T. forsythia 为 28%、对 F. alocis 为 36%（p < 0.001）。所有浓度均观察到抗菌效果，即使最低浓度也未见活力恢复。

在“细胞培养用于细胞毒性检测（Cell culture for cytotoxicity assays）”中，研究人员用刃天青法检测 HGF 活力。J. dioica 呈剂量依赖性效应。5 和 15 μg/ml 在培养 1、5、7 天时活力与对照相似。培养 3 天时所有浓度均使活力下降：5、15、30、300 μg/ml 分别降低 18.82%、18.52%、19.86%、21.49%。300 μg/ml 最不利于细胞活力，3 天降低 21.49%，5 天降低 25.94%（OD₅₇₀ 分别为 0.265 和 0.257，对照为 0.3375 和 0.347）。尽管初期下降，细胞继续生长；第 7 天，5 μg/ml 组活力比对照增加 9.29%（OD₅₇₀ 0.388 比 0.355），15 μg/ml 增加 2.53%（0.364）；30 和 300 μg/ml 分别降低 5.08%（0.337）和 11.7%（0.3135），对照为 0.355。总体上，所有浓度培养 7 天后细胞活力保持在 80% 以上。

讨论部分指出，不同体外研究报告了 J. dioica 的抗菌和抗氧化特性，方法虽有差异，但多数与本研究抗菌结果一致。既往对口腔细菌的研究表明，J. dioica 根提取物对 S. mutans 有抗菌活性，MIC 为 3.75 mg/ml；J. dioica 还对 Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli 显示抗菌作用；其己烷提取物对多种细菌包括植物病原菌有相关抗菌活性。J. dioica 的抗菌特性归因于多酚类化合物、黄酮类和抗氧化活性，这或可解释其传统用于治疗牙齿松动。牙周炎体征和症状反映宿主对生物膜失衡的复杂免疫反应；活性氧（reactive oxygen species，ROS）在调节免疫系统细胞、促进破骨细胞活化和启动骨吸收中起关键作用。J. dioica 提取物具有抗菌和抗氧化特性，可能通过抵消 ROS 效应调节免疫反应，因此可能作为牙周病管理的潜在辅助剂；这一提议得到既往体内外结果支持，也与本研究一致。鉴于 J. dioica 的多种益处，其符合当前消费者需求，一些公司已成功上市含天然提取物的口腔卫生产品，如含桉叶油醇、薄荷醇、水杨酸甲酯和百里香酚的漱口水，以及含 Eucalyptus globulus、Citrus limon、Citrus aurantifolia、Aloe barbadensis、Curcuma longa、Mentha spicata 天然提取物的牙膏；临床试验和体外研究支持这些精油和植物提取物作为口腔卫生产品成分。本研究表明低剂量 J. dioica 提取物可作为口腔细菌细胞抗增殖剂。类似植物 Sanguinaria canadensis 含苯并菲啶生物碱和 chelerythrine 结构同系物，具有抗菌、抗氧化和抗炎特性，但其作用机制仍不完全清楚且报道矛盾；Akhtar 等显示 S. canadensis 通过线粒体和半胱天冬酶依赖途径诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，产生氧化应激并抑制细胞增殖，但与紫外线辐射和 DNA 嵌入剂等已知致癌物共享分子作用机制。研究人员认为，本研究结果提示 J. dioica 提取物对细菌和哺乳动物细胞具有选择性效应：HGF 等哺乳动物细胞对该化合物显示低毒性，而细菌细胞即使在低剂量下也表现细胞毒性。有些研究指出特定化合物负责药用植物提取物的生物活性，另一些研究认为植物成分可能协同作用；本研究所用植物提取物含多种成分，因此对不同细胞类型观察到的效应可能源于多种机制而非单一机制。例如，由于亲脂特性，J. dioica 中发现的萜类如 citralitrione 已知可损伤生物膜。目前 J. dioica 在局部疗法和漱口水作为牙周病管理辅助剂的使用增加，因此需进一步研究确定其作用机制；此外，开发非致瘤人细胞系模型可提供对 J. dioica 使用风险的相关且准确评估。

结论翻译：本研究结果表明，J. dioica 提取物对 T. forsythia 和 F. alocis 两种与牙周病发展相关的关键病原体具有显著抗菌活性。提取物显示剂量依赖性抑制，较低浓度观察到最高水平细菌抑制。此外，细胞毒性实验表明，尽管提取物最初降低 HGF 活力，但随时间以剂量依赖性方式促进细胞活力。综合这些结果，J. dioica 提取物具有相关抗菌特性，对人成纤维细胞细胞毒性最小，突出其作为牙周治疗天然辅助剂的潜力。然而，需要进一步研究确认其牙科应用的临床疗效和安全性。