瘤内融合性外膜囊泡通过肿瘤MHC-I上调和肿瘤细菌化协同免疫–代谢调控增强抗肿瘤免疫

《Advanced Science》：Intratumoral Fusogenic Outer Membrane Vesicles Enhance Antitumor Immunity Through Tumor MHC-I Upregulation and Tumor Bacterization

　　

冷肿瘤通过低免疫原性、抗原呈递缺陷和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）逃避抗原呈递细胞（APC）和T细胞监视。研究人员揭示了细菌外膜囊泡（OMV）的一种非经典功能，即OMV激活TLR4–NF-κB–NLRC5轴以诱导肿瘤MHC I上调，从而恢复肿瘤对T细胞的可见性。为进一步消除肿瘤对APC的不可见性，研究人员报道了一种细菌启发策略，驱动APC将肿瘤细胞感知为细菌。通过将OMV与融合性脂质体融合，研究人员构建了融合性OMV（FO），其将细菌膜组分锚定到肿瘤表面，从而在功能上“细菌化”肿瘤细胞。该修饰显著增加了APC募集，并有效将APC感知从沉默的肿瘤清除重编程为主动的微生物样免疫监视。因此，APC对细菌化肿瘤表现出增强的吞噬摄取，使肿瘤抗原库能够高效交叉呈递至T细胞。同时，OMV上调肿瘤细胞上的MHC I表达，增强了效应T细胞对肿瘤的识别和细胞毒性。此外，通过将3-溴丙酮酸（3BP）装载到囊泡中，研究人员赋予该系统代谢重编程能力，其特征为糖酵解抑制和乳酸耗竭。总之，协同的免疫–代谢调控在瘤内给药后导致肿瘤进展的持久抑制，为克服免疫冷肿瘤中的关键免疫屏障提供了一种细菌化启发的纳米平台。

研究背景方面，许多实体瘤尤其是冷肿瘤，通过低免疫原性、抗原呈递缺陷和免疫抑制性TME逃避APC和T细胞监视。具体而言，树突状细胞（DC）感知死亡肿瘤细胞和损伤相关分子模式的能力受到肿瘤相关巨噬细胞（TAM）介导的胞葬作用损害；肿瘤相关抗原（TAA）表观沉默和MHC I下调使肿瘤细胞逃避免疫识别；免疫抑制细胞群、营养限制和代谢废物积累共同损害肿瘤浸润DC和效应T细胞（Teff）功能。尽管瘤内免疫和原位癌症疫苗可将肿瘤转化为内源性抗原库并提供局部免疫刺激，但现有策略多强调抗原释放或局部佐剂刺激，较少同时增强APC对肿瘤的感知、恢复肿瘤对Teff的可见性并缓解抑制性TME。OMV天然携带病原体相关分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）和外膜蛋白，可通过Toll样受体（TLR）参与抗肿瘤免疫并重塑TME，但其克服冷肿瘤免疫屏障的系统免疫调节机制尚不清楚，因此研究人员开展该研究。

研究人员鉴定了OMV上调肿瘤MHC I表达的非经典功能并阐明机制；将OMV与融合性脂质体杂交构建FO，以“细菌化”肿瘤细胞；进一步负载3BP构建3BP@FO。研究结论表明，FO将OMV锚定于肿瘤细胞膜，增强肿瘤免疫原性，促进APC募集和细菌化肿瘤细胞摄取，使APC从沉默肿瘤清除转向微生物样免疫监视，并促进肿瘤抗原库交叉呈递和Teff激活；OMV通过TLR4–NF-κB–NLRC5轴上调肿瘤MHC I，增强Teff识别和细胞毒性；3BP@FO抑制己糖激酶-2（HK-II）、阻断糖酵解并减少TME乳酸，协同重塑TME，诱导持久免疫记忆，抑制肿瘤生长、转移和复发，并增强检查点阻断响应。该研究提供了细菌化启发的免疫代谢纳米平台，对克服冷肿瘤关键免疫屏障具有重要意义，论文发表在《Advanced Science》。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用Escherichia coli BL21来源OMV，与DMPC/DOTAP/DSPE-mPEG2000脂质体杂交挤出制备FO，电穿孔装载3BP制备3BP@FO；使用B16、B16-OVA、MCF-7、A549和CT26细胞系，雌性C57BL/6N小鼠（购自北京大学健康科学中心）和BALB/c小鼠；结合转录组测序、qPCR、Western blot、流式细胞术、共聚焦显微成像、Transwell迁移、吞噬和抗原呈递共培养、LDH杀伤实验、皮下瘤模型、B16肺转移模型和术后再攻击模型。

研究结果方面，2.1 OMVs Upregulate MHC I Expression on Tumor Cell Surface：通过将Escherichia coli BL21来源OMV与肿瘤细胞共孵育，发现OMV增加B16黑色素瘤细胞MHC I表达，H-2K^b和H-2D^b mRNA水平升高，MHC I⁺肿瘤细胞比例和平均表达增加；MCF-7和A549细胞也出现MHC I上调，B16-OVA细胞OVA呈递效率和水平增强。RNA-seq显示OMV上调504个基因，包括H-2K1、H-2D1、H2-Q4等MHC I相关基因；GO分析富集MHC I肽加载复合物和MHC I蛋白复合物；KEGG富集NLR、TLR和TNF信号通路。OMV增加Nlrc5、Nfkb和TLR4表达；Okanin抑制TLR4/NF-κB后MHC I上调减弱。结论：OMV通过激活TLR4–NF-κB–NLRC5通路增强肿瘤细胞表面MHC I表达。

2.2 Construction of Fusogenic OMVs to Bacterize Tumor Cells：通过将OMV与膜融合性脂质体杂交制备FO；当OMV与脂质体质量比4:1时，FO与B16细胞融合效率与1:1相当，LPS信号大量出现在肿瘤细胞表面，荧光共定位强；OMV可在肿瘤表面持续存在，12 h内LPS⁺肿瘤细胞比例从约85.9%降至约64.1%。结论：FO有效将OMV呈递于肿瘤细胞膜，生成细菌样肿瘤细胞。

2.3 Bacteria-Mimicking Tumor Cells Mobilize and Promote DC Antigen Presentation：通过Transwell实验，FO处理的细菌模拟肿瘤细胞募集最多骨髓来源树突状细胞（BMDC）；吞噬实验中FO组BMDC对肿瘤细胞摄取效率较原始肿瘤细胞增加超过1.9倍；FO增强DC成熟和OVA抗原呈递。结论：细菌化肿瘤细胞增强DC募集、吞噬、成熟和抗原呈递。

2.4 Bacterized Tumor Cells Elicit Robust Adaptive Antitumor Immunity：通过体外T细胞活化实验，FO组CD8⁺CD69⁺ T细胞较PBS增加2.8倍。体内实验中，FO使CD45^?肿瘤细胞LPS⁺比例增加1.8倍；FO增加TME成熟APC，淋巴结CD4⁺和CD8⁺ T细胞分别增加2.1和2.4倍，CD8⁺IFN-γ⁺增加1.6倍；脾T细胞杀伤最强，且对FO细菌化肿瘤细胞杀伤强于原始肿瘤细胞，说明MHC I上调关键。M2巨噬细胞被重编程为M1表型，恢复DC抗原呈递。结论：细菌化肿瘤细胞引发强效适应性抗肿瘤免疫。

2.5 Metabolic Inhibitor–Loaded FOs Reprogram the TME for Durable Antitumor Immunity：通过制备3BP@FO，确认3BP装载效率20.9%，水合粒径约134.7 nm，至少5天胶体稳定，OMV蛋白组成保留；3BP@FO将3BP递送至肿瘤胞质，抑制HK-II，肿瘤摄取增加，瘤内乳酸较PBS和游离3BP分别降低1.5倍和1.3倍。TME分析显示3BP@FO增加DC和巨噬细胞1.9倍和3.4倍，CD8⁺ T细胞浸润最高，CD8⁺/CD4⁺ T细胞比增加，自然杀伤（NK）细胞增加3.1倍，调节性T细胞（Treg）减少6.2倍和3.2倍；CD8⁺CD69⁺从21.1%升至58.4%，Ki67⁺和TCF1⁺升高。结论：3BP@FO增强肿瘤免疫原性并将TME重塑为免疫允许状态。

2.6 3BP@FO Suppresses Tumor Progression and Enhances Checkpoint Blockade Responsiveness：在B16模型中，OMV和FO抑瘤率分别为59.5%和72.3%，3BP@FO肿瘤控制率81.62%，中位生存38天，较PBS延长12天；3BP@FO联合αPD-1抑瘤率91.09%，50%小鼠生存超过50天，而PBS组27天内全部死亡，αPD-1单独仅延长中位生存1.5天。治疗期间无显著体重下降，DiR标记显示荧光主要局限于肿瘤72 h，未见主要器官明显积累，安全性良好。CT26模型中3BP@FO抑瘤率88.71%，33.3%小鼠生存超过60天。结论：3BP@FO抑制肿瘤进展并增强检查点阻断响应。

2.7 3BP@FO Induces Short- and Long-Term Immune Memory to Prevent Melanoma Metastasis and Recurrence：通过检测脾脏记忆T细胞，3BP@FO使效应记忆T细胞（CD44⁺CD62L^?）较PBS增加5.7倍；B16肺转移模型中3BP@FO增加肺内CD8⁺ T细胞并减少肺肿瘤定植，转移灶数为PBS组五分之一；术后再攻击模型中3BP@FO抵抗复发，复发肿瘤Ki67信号最弱；终点脾脏CD8⁺ T细胞在OMV、FO、3BP@OMV和3BP@FO组分别较PBS增加21.66%、32.36%、27.3%和36.38%，3BP@FO诱导效应记忆T细胞最高，分别为PBS、OMV、FO和3BP@OMV组的3.76、2.21、1.75和1.83倍。结论：3BP@FO诱导短期和长期免疫记忆，预防黑色素瘤转移和复发。

讨论部分总结：讨论指出，许多实体瘤低免疫原性和抗原呈递低效限制APC和Teff识别；仅针对单一识别通路的策略不能完全激活有效肿瘤清除所需的癌症–免疫循环。本研究构建融合性OMV，在细菌化肿瘤的同时上调肿瘤表面MHC I，使肿瘤更易被APC识别为“非己”，并通过TLR4/NF-κB/NLRC5轴促进Teff识别，从而破坏冷肿瘤免疫逃逸。负载3BP后，3BP@FO保留免疫原性作用并重塑瘤内免疫组成，减少免疫抑制因素，增强APC和Teff长期活性，促进持久免疫记忆，抑制肿瘤生长、转移和复发，且安全性和生存获益良好。该平台通过细胞膜和细胞代谢同时干预，形成多维调控系统，可与免疫检查点抑制剂、过继T细胞转移或癌症疫苗整合。瘤内给药提高局部生物利用度并减少系统暴露及免疫相关不良事件风险。FO优先融合CD45^?肿瘤细胞而非CD45⁺免疫细胞，可能源于吞噬能力和膜电荷差异；但APC对FO的摄取不可避免，3BP也可能直接影响APC代谢和功能，不能排除。未来需要细胞类型特异性代谢分析和靶向扰动，区分肿瘤细胞介导效应与直接免疫细胞效应。其他瘤内细胞类型参与融合尚待探索，肿瘤靶向配体修饰可能改善选择性融合。直接抗原交叉呈递评估主要基于B16-OVA模型和H-2K^b–SIINFEKL复合物检测，当前数据直接证明模型抗原OVA呈递增强，而非同时呈递多种内源性肿瘤抗原；需免疫肽组学和抗原特异性T细胞分析。系统微环境调控、多模型验证及与其他免疫治疗整合对转化潜力至关重要。

研究结论翻译：总之，协同的免疫–代谢调控在瘤内给药后导致肿瘤进展的持久抑制，为克服免疫冷肿瘤中的关键免疫屏障提供了一种细菌化启发的纳米平台。