负载Garcinol的PLGA纳米粒嵌入壳聚糖–泊洛沙姆温敏原位凝胶经鼻-脑递送改善糖尿病诱导大鼠认知功能障碍：开发、表征与疗效验证

《RSC Pharmaceutics》：Garcinol-loaded PLGA nanoparticle-embedded chitosan–poloxamer-based thermoresponsive gel administered through nose-to-brain delivery ameliorated diabetes-induced cognitive dysfunction in rats: development, characterization, and efficacy validationOpen Access

该研究工作报道了通过纳米粒嵌入原位凝胶系统递送Garcinol在糖尿病诱导阿尔茨海默病（AD，Alzheimer's disease）大鼠模型中改善认知与行为表现的有效性。实验性载Garcinol纳米粒（GNPs，garcinol-loaded nanoparticles）通过常规溶剂蒸发–纳米沉淀法制备，随后进行Zeta电位、平均粒径分析、原子力显微镜（AFM，atomic force microscopy）、扫描电子显微镜（SEM，scanning electron microscopy）、透射电子显微镜（TEM，transmission electron microscopy）、载药效率%和体外药物释放评价。选定的GNPs被载入壳聚糖–泊洛沙姆基原位凝胶系统并进行表征。表征数据显示，球形、纳米尺寸的GNPs-G具有78.4 ± 1.3 nm平均粒径、0.2 ± 0.06 PDI（polydispersity index，多分散指数）、?37.9 ± 0.7 Zeta电位和23.89% ± 1.5%载药量，并在24 h研究期内持续释放。实验性纳米粒嵌入凝胶（GNPs-G）表现出满意的胶凝温度（34.5 °C ± 0.2 °C）、凝胶强度（40.68 ± 1.6 s）、黏膜黏附强度（4289.37 ± 62.9）和黏度（3767 ± 45.5 cps），并具有Garcinol的离体持续渗透。与粗Garcinol和ARICEPT?相比，鼻内给予GNPs-G导致记忆和行为表现的有效恢复。体内研究进一步揭示，在接受GNPs-G的大鼠中，内源性抗氧化剂如超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）、谷胱甘肽（GSH，glutathione）和过氧化氢酶（CAT，catalase）的含量得到恢复，并与ARICEPT?/Garcinol治疗组进行比较。海马区组织学评估验证了体内疗效分析，因为与Garcinol/疾病对照组相比，GNPs-G组观察到正常神经元结构显著重建。总之，目前的研究结果支持GNPs-G在缓解糖尿病诱导AD中的治疗潜力。然而，需要额外的临床前研究来验证制剂的长期疗效和转化潜力。

研究背景：近年来，植物生物活性成分因可持续、生物相容、可生物降解、无毒、低成本、环保等特点受到关注。AD近乎不可治愈并需终生干预；现有USFDA批准药物多靶向乙酰胆碱酯酶（AChE，acetylcholinesterase）或N-methyl-d-aspartic acid受体，主要缓解症状而非对因，且常伴肝毒性、腹泻或失眠等不良反应，并受血脑屏障（BBB，blood–brain barrier）限制。糖尿病相关认知障碍和AD进展是重要神经退行性状况，其病理机制涉及葡萄糖调节、脑胰岛素敏感性或抵抗、线粒体功能障碍、促炎细胞因子、活性氧和糖基化终产物等。Garcinol来源于Garcinia属，主要为Garcinia indica（Clusiaceae），具抗炎、抗胆碱酯酶、抗氧化和组蛋白乙酰转移酶抑制等作用。既往in silico研究提示Garcinol与淀粉样前体、β分泌酶-1、AChE、γ分泌酶和tau蛋白激酶-1等AD关键蛋白有结合亲和力，但尚无载Garcinol纳米粒经鼻-脑途径在合适糖尿病诱导AD模型中的抗AD潜力验证。研究人员因此开发GNPs并载入壳聚糖–泊洛沙姆凝胶GNPs-G，以促进鼻-脑应用。

关键技术方法：采用改良纳米沉淀–溶剂蒸发法制备GNPs；通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，Fourier transform infrared spectroscopy）、差示扫描量热法（DSC，differential scanning calorimetry）、X射线衍射（XRD，X-ray diffraction）、Zeta电位/粒径/PDI、SEM、AFM、TEM、载药和体外释放及动力学模型评价；将GNP-2载入壳聚糖–泊洛沙姆温敏原位凝胶，评价胶凝温度/时间、凝胶强度、黏度、流变性、黏膜黏附、离体渗透、稳定性和鼻纤毛毒性；用DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-二苯基-1-苦基肼）、ABTS、FRAP（ferric reducing antioxidant power，铁还原抗氧化能力）、NO、AChE抑制和MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，四甲基偶氮唑盐）评估。动物来源：印度Siksha ‘O’ Anusandhan大学中央动物设施42只3月龄、185–200 g albino大鼠，STZ（streptozotocin，链脲佐菌素）45 mg kg^?1腹腔注射诱导AD；细胞为ATCC CTX TNA2和Salk Institute HT-22。

研究结果：
3.1 GNPs的制剂开发与理化评价：制备不同批次GNP-1、GNP-2和GNP-3，GNP-2最优，产率83.5% ± 1.1%，载药23.89% ± 1.5%，载药效率85.2% ± 2.6%，粒径78.4 ± 1.3 nm，PDI 0.2 ± 0.06，Zeta电位?37.9 ± 0.7 mV。
FTIR分析：Garcinol、PLGA、SL、PVA、物理混合物和GNPs特征峰无明显位移，提示药物与辅料相容，弱物理作用可能贡献稳定性。
DSC分析：Garcinol在139.89 °C有吸热峰，GNPs为59.57 °C，Garcinol特征熔融峰消失，表明其由结晶态转为无定形态。
XRD分析：Garcinol显示尖锐衍射峰，GNPs无尖锐峰且强度降低，支持无定形转化，利于溶出。
产率、载药百分比和载药效率：GNP-2最高，GNP-1次之，GNP-3较低。
粒径、Zeta电位和PDI分析：GNP-2粒径最小、PDI最低、负Zeta电位较高，胶体稳定性更好，选为后续研究。
SEM：GNP-2呈球形、表面光滑、分布均匀，尺寸约在100 nm内。
AFM：GNP-2近球形、光滑、密集，2D高度?60至+60 nm，3D高度?108.98至+108.98 nm，平均表面高度约29.17 nm，无明显孔或表面裂纹。
TEM：GNP-2均匀球形，表面完整，具电子致密核心，尺寸小于100 nm，与DLS一致。
Garcinol体外释放与释放动力学：24 h内持续释放，累积释放88.85% ± 2.8%，Higuchi模型拟合最佳，R²=0.9268。
3.2 GNP-2嵌入凝胶（GNP-2G）的制剂与理化评价：制备GNP-2G1至GNP-2G4，GNP-2G3最优，pH 6.5 ± 1.4，胶凝温度34.5 °C ± 0.2 °C，胶凝时间18.23 ± 0.9 s，凝胶强度40.68 ± 1.6 s，黏度3767 ± 45.5 cps，铺展性7.1 ± 1.5 g cm s^?1，黏膜黏附强度4289.37 ± 62.9 dynes per cm²，流变为假塑性/剪切变稀。
Ex vivo渗透：GNP-2G3经羊鼻黏膜24 h渗透77.77% ± 3.3%，符合Higuchi模型，R²=0.9336。
稳定性研究：在40 °C ± 2 °C/75% ± 5% RH下3个月，外观、胶凝温度、凝胶强度、黏度和黏膜黏附强度无明显变化。
鼻纤毛毒性研究：H&E染色显示GNP-2G3组与未处理对照组无显著组织学改变，提示生物相容。
体外抗氧化测定评价：DPPH、ABTS、FRAP和NO实验中，GNP-2G3抗氧化活性强于Garcinol，部分强于或接近抗坏血酸；50 μg mL^?1时DPPH抑制98.33% ± 4.37%，ABTS抑制98.51% ± 2.37%，FRAP 91.89% ± 6.22%，NO抑制95.37% ± 4.64%。
体外AChE活性：GNP-2G3抑制AChE达90.76% ± 2.37%，高于Garcinol的79.88% ± 5.12%，接近donepezil的92.98% ± 4.37%。
GNP-2G3体外细胞相容性评价：MTT显示CTX TNA2和HT22细胞在50 μg mL^?1下存活率仍分别达86.79% ± 1.13%和87.56% ± 2.76%，提示无毒、生物相容。
3.3 体内神经行为学评价：STZ诱导后，GNP-2G3（2 mg kg^?1和5 mg kg^?1）改善神经行为，且5 mg kg^?1优于2 mg kg^?1，并优于ARICEPT?和Garcinol。
体重评价：STZ降低大鼠体重和脑重，各治疗组可逆转，GNP-2G3改善最明显。
Y迷宫：STZ降低自发交替行为，GNP-2G3提高自发交替行为，高剂量效果最好。
旷场试验：STZ减少穿越次数，GNP-2G3增加穿越次数，优于ARICEPT?和Garcinol。
被动回避试验：STZ降低步入潜伏期，GNP-2G3提高潜伏期，高剂量优于低剂量。
Morris水迷宫：STZ增加逃避潜伏期，GNP-2G3降低逃避潜伏期，提示空间学习和记忆改善。
3.4 体内氧化应激和神经化学评价：STZ降低SOD、CAT和GSH，升高MDA；GNP-2G3恢复抗氧化指标并降低MDA，优于ARICEPT?和Garcinol，呈剂量依赖。
亚硝酸盐含量估计：STZ升高脑亚硝酸盐，GNP-2G3降低亚硝酸盐，优于ARICEPT?和Garcinol。
AChE含量估计：STZ升高AChE，GNP-2G3降低AChE，优于ARICEPT?和Garcinol，高剂量更强。
Aβ_1–42含量估计：STZ升高Aβ_1–42，GNP-2G3降低Aβ_1–42，优于ARICEPT?和Garcinol，高剂量最强。
3.5 组织病理学观察：STZ组海马CA1、CA2、CA3、CA4和DG出现神经元损伤、深染固缩核和细胞减少；GNP-2G3恢复海马正常细胞结构，减少固缩和坏死，效果优于Garcinol。

讨论部分总结：研究人员指出，鼻-脑递送可绕过BBB，温敏原位凝胶可增强鼻腔滞留、限制系统损失并持续释药。Garcinol与辅料相容性良好，DSC和XRD证实其在纳米粒中转为无定形。GNP-2具有良好产率、载药、粒径、PDI和负Zeta电位，SEM、AFM和TEM证实其球形、光滑和完整结构。GNP-2体外释放符合Higuchi模型，提示扩散和侵蚀控制。GNP-2G3具有适宜温敏胶凝、流变、黏膜黏附和离体渗透，稳定性与鼻黏膜安全性良好，并增强抗氧化和AChE抑制，MTT显示对正常神经元和脑细胞无毒。STZ可诱导AD样病理，GNP-2G3通过鼻-脑途径改善行为、氧化应激、亚硝酸盐、AChE和Aβ_1–42，并保护海马组织。

结论部分翻译：本研究提出了一种新型、简便、生物相容的Garcinol纳米局部制剂，用于改善糖尿病诱导AD大鼠模型中的认知缺陷。SEM和AFM图像证明GNPs成功形成。GNPs的纳米尺寸适合有效渗透鼻上皮，而持续药物释放特征进一步有利于其在脑组织中的期望滞留和定位。鼻黏膜组织病理学研究支持GNP-2G3无毒，MTT测定进一步证实。实验性GNP-2G3在黏度、凝胶强度、流变学和黏膜黏附方面表现出有利特征，表明其适合鼻内应用。与ARICEPT?治疗组相比，实验性GNP-2G3显著改善AD大鼠的认知和行为功能。体内抗氧化和神经化学分析合理化了GNP-2G3的有效神经保护功效。在组织病理学分析中观察到类似结果，与ARICEPT?/Garcinol治疗组相比，GNP-2G3治疗组神经元细胞明显恢复。总体而言，这些发现表明GNP-2G3在改善AD认知功能障碍中的神经保护有效性。研究人员认为，本研究的临床前发现将为GNP-2G3的进一步临床前安全性、疗效和慢性毒性评价研究奠定基础，以建立其临床可行性。