基于透明质酸-泊洛沙姆共聚物功能化的抗癌低共熔溶剂纳米颗粒的绿色制备方法

《RSC Pharmaceutics》：Green approach for the development of anticancer deep eutectic solvent-based nanoparticles functionalized by hyaluronic acid-poloxamer copolymersOpen Access

　　

纳米医学已被用于解决一系列医学问题，尤其是癌症。然而，载药纳米颗粒（NPs）的制备方案需要使用有机溶剂，这可能对环境和人类健康造成危害。已有广泛研究将治疗性低共熔溶剂（TheDESs）视为传统有机溶剂的有前景的替代品。在本研究中，研究人员探讨了一种绿色方法，用于开发经透明质酸（HA）功能化的抗肿瘤低共熔溶剂基纳米颗粒（ENPs）。透明质酸以其对CD44受体的强亲和力而著称，从而提高了其对肿瘤细胞的靶向能力。为实现这一目标，研究人员制备了两种包含生物活性分子的TheDESs，即S-香芹酮/RS-酮洛芬和百里醌/dl-薄荷醇。随后，所得体系被用于制备由两亲性生物相容性聚合物（即泊洛沙姆407）稳定的ENPs。这些被表征为纳米乳剂的纳米颗粒在125天内保持稳定，平均尺寸为36 ± 4 nm，多分散指数低于0.2。它们还对结直肠癌（CT26）和肺癌（3LL）细胞系表现出与TheDESs相当的抗肿瘤效果。上述细胞系显示出显著的CD44受体表达水平（>95%；CD44⁺）。因此，研究人员进行了化学合成以制备泊洛沙姆接枝透明质酸（P407-g-HA）共聚物，该共聚物随后通过自组装生成修饰的ENPs（HA-ENPs）。将HA添加至ENPs表面可产生更大的纳米颗粒，平均直径为162 ± 23 nm，并且与无HA的ENPs相比，增强了与CD44⁺肿瘤细胞的相互作用。最后，研究人员成功配置了实验室开发的微流控装置以生产ENPs，从而确保了工艺的可重复性，并为扩大生产规模铺平了道路。因此，本工作开发的工艺展示了将多种生物活性分子结合以借助便利的稳定剂配制低共熔体系基NPs的巨大潜力。

**研究背景**

癌症仍是当今最具挑战性和破坏性的疾病之一。尽管化疗、放疗和免疫疗法等治疗手段不断发展，但这些传统疗法常伴有严重副作用和有限特异性，给患者生活质量带来沉重负担。近年来，纳米颗粒（NPs）作为药物递送系统在癌症治疗中展现出创新潜力，可减少对健康组织的损伤，并通过靶向肿瘤细胞和改善活性药物成分（APIs）的溶解度来提高药物生物利用度。然而，大多数载药NPs的制备方法需要使用有机溶剂，这对环境和人类健康构成危害。治疗性低共熔溶剂（TheDESs）因其生物相容性和相对低毒性而成为传统有机溶剂的绿色替代品。TheDESs是由至少两种不同组分（含至少一种API）组成的共晶混合物，熔点低于理想混合物及各组分熔点。尽管具有上述优势，TheDESs的抗癌活性研究仍十分有限。

**研究内容与意义**

研究人员开发了一种绿色方法，制备经透明质酸（HA）功能化的抗肿瘤低共熔溶剂基纳米颗粒（ENPs）。研究人员制备了S-香芹酮/RS-酮洛芬（CAR/KET）和百里醌/dl-薄荷醇（TQ/MEN）两种TheDESs，并用以制备由两亲性生物相容性聚合物泊洛沙姆407（P407）稳定的ENPs。所得纳米乳剂在125天内保持稳定，平均尺寸36 ± 4 nm，多分散指数（PdI）低于0.2，对结直肠癌（CT26）和肺癌（3LL）细胞系表现出与TheDESs相当的抗肿瘤效果。研究人员进一步合成泊洛沙姆接枝透明质酸（P407-g-HA）共聚物，通过自组装生成HA功能化ENPs（HA-ENPs），其平均直径为162 ± 23 nm，与CD44⁺肿瘤细胞的相互作用显著增强。最后，微流控装置成功用于ENPs生产，确保工艺可重复性并为规模化生产铺平道路。本工艺展示了结合多种生物活性分子、借助便利稳定剂配制共晶体系基NPs的潜力。

**关键技术方法**

主要技术方法包括：卡尔·费休库仑滴定法和差示扫描量热法（DSC）用于TheDESs的制备与热学表征；声空化辅助配制法（手动注射或微流控）用于制备ENPs；动态光散射（DLS）测定粒径和PdI；两步化学合成法制备P407-g-HA共聚物，并经¹H NMR、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和体积排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）表征；MTT法评估体外抗癌活性；流式细胞术评估CD44受体表达；纳米等温滴定量热法（Nano-ITC）评估纳米颗粒与肿瘤细胞相互作用及接枝产率。细胞系来源：CT26（ATCC? CRL-2638?）和3LL（ATCC? CRL-1642?）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），MCF-7细胞作为CD44^-对照。

**研究结果**

3.1 TheDESs的制备与表征：通过DSC实验构建了TQ/MEN体系的固-液相图，共晶组成为TQ摩尔分数33%，共晶点约16.8 °C。CAR/KET体系在CAR摩尔分数约80%时达到共晶组成，FTIR分析证实KET的-COOH与CAR的C=O之间形成氢键。

3.2 P407稳定的ENPs（HA-free ENPs）的制备：研究人员采用声空化辅助配制法，优化了TheDES与P407的比例，确定P407最低稳定浓度（TQ/MEN为0.1% w/w，CAR/KET为0.15% w/w），理论载药量分别为17%和41%。

3.3 P407稳定ENPs的表征：手动注射制备的ENP(TQ/MEN)粒径34 ± 3 nm（PdI=0.101），ENP(CAR/KET)粒径41 ± 3 nm（PdI=0.142）；微流控制备的ENPs同样具有单分散性和低PdI（<0.2）。稳定性评估显示，ENP(TQ/MEN)在4 °C和室温下125天内保持稳定；ENP(CAR/KET)在室温下稳定，4 °C下出现可逆的浑浊现象。

3.4 P407-g-HA共聚物的合成与表征：通过两步化学合成获得P407-g-HA，¹H NMR、FTIR和SEC-HPLC表征证实共聚物成功形成，SEC-HPLC显示共聚物保留时间提前至约10.4 min，表明分子量显著增加。

3.5 HA-ENPs的制备与表征：HA-ENP(TQ/MEN)平均粒径162 nm，大于HA-free ENPs（41 nm）。对照实验表明，HA与P407的物理混合不能实现表面功能化，必须通过化学接枝。

3.6 体外生物学评价：MTT实验显示，TQ对CT26和3LL细胞系的半数抑制浓度（IC50）分别为19 μM和42 μM，CAR的IC50分别为1.54 mM和1.03 mM；TheDES(CAR/KET)和ENP(CAR/KET)的活性优于CAR单独使用，归因于KET的抗炎作用可能增强抗癌活性。HA-ENP(TQ/MEN)与HA-free ENP(TQ/MEN)的细胞毒性相当。流式细胞术显示，CT26和3LL细胞系的CD44受体表达率分别为98.6%和99.8%，MCF-7仅为2.3%。Nano-ITC实验证实，HA-ENP(TQ/MEN)与CD44⁺ CT26细胞的相互作用显著强于HA-free ENPs，且与CD44^- MCF-7细胞的相互作用较弱，证明HA功能化增强了靶向CD44⁺肿瘤细胞的能力。通过Nano-ITC估算P407-g-HA中HA含量为43.8%。

**讨论与结论**

讨论部分指出，HA表面修饰使纳米颗粒尺寸增大，但仍处于肿瘤治疗适宜范围；HA-CD44相互作用可促进纳米颗粒内化；Nano-ITC首次被用于估算接枝反应产率，展示了其在表征功能化纳米颗粒方面的新应用。研究结论强调，本工作开发了两种新型ENP系统（CAR/KET和TQ/MEN），平均尺寸36 ± 4 nm，PdI低于0.2，至少稳定四个月。该绿色制备工艺避免了有机溶剂的使用、采用节能仪器且无废物产生。P407-g-HA共聚物可推广至其他类型NPs的功能化。本工作凸显了共晶体系在纳米医学领域的潜力，为选择两种相容的API配制合适的TheDES以治疗癌症及其他疾病开辟了新方向。