脂聚合物纳米载体靶向沉默NLRP3用于IL-1β介导自身炎症性疾病的精准治疗

《RSC Pharmaceutics》：Targeted NLRP3 silencing with lipopolymer nanocarriers for precision therapy in IL-1β-mediated autoinflammatory diseasesOpen Access

　　

目的：炎症性疾病可能源于先天免疫失调，通常由NLRP3炎症小体的病理性激活驱动，该炎症小体促进caspase-1介导的白细胞介素-1β（IL-1β）的成熟与分泌。虽然IL-1阻断生物制剂可提供临床获益，但其疗效受限于不完全应答、免疫原性以及无法直接靶向失调的炎症小体。基于小干扰RNA（siRNA）的疗法提供了一种精准沉默NLRP3的手段，然而其治疗转化受到RNA不稳定及免疫细胞摄取效率低下的阻碍。为弥补这一空白，研究人员开发了负载siRNA、由脂质修饰的聚乙烯亚胺脂聚合物（LPNPs）组成的纳米颗粒，用于靶向沉默Nlrp3/NLRP3——该上游传感器蛋白的激活调控炎症小体组装及IL-1β释放。 方法：研究人员采用多种靶向Nlrp3（小鼠）和NLRP3（人）的siRNA序列，利用优化的脂聚合物递送系统PEI-C，以筛选最有效的沉默候选序列。siRNA治疗的体外疗效在小鼠巨噬细胞和人外周血单个核细胞（PBMCs）中评估，随后在LPS诱导的小鼠模型中进行体内评估。 结果：筛选出的siRNA（siNlrp3_3和siNLRP3_3）实现了显著的转录本敲低，并在所用细胞模型中有效抑制了脂多糖（LPS）诱导的IL-1β产生。在中毒性休克小鼠模型中，全身给予负载siNLRP3-3的LPNPs显著减弱了IL-1β分泌，尤其在肺（p = 0.0079）和脾（p = 0.0159）等免疫细胞密集组织中效果显著。来自15名健康供体的离体人PBMCs研究证实了转化潜力，大多数样本显示IL-1β显著降低（p = 0.0107），尽管存在一定个体间差异。 结论：这些发现证明PEI-C配制的LPNPs能够实现Nlrp3/NLRP3沉默并有效抑制细胞因子分泌。通过靶向NLRP3沉默，该LPNPs为NLRP3驱动性疾病的管理奠定了基础。

论文解读

一、研究背景与目的

炎症性疾病是一类以反复发作的炎症为特征的疾病，通常不涉及自身抗体或抗原特异性T细胞，也无明确感染性病因。先天免疫系统失调是其根本原因，导致不恰当的时间和空间性炎症。这些疾病常与NOD样受体（NLR）家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体活性改变相关。NLRP3炎症小体是一种胞质多蛋白复合物，由传感器蛋白NLRP3招募衔接蛋白ASC（含caspase激活和招募结构域的凋亡相关斑点样蛋白）和pro-caspase-1组装而成。NLRP3活性改变导致的IL-1分泌升高，是冷吡啉相关周期性综合征（CAPS）、TNF受体相关周期性综合征（TRAPS）和家族性地中海热（FMF）等系统性自身炎症性疾病（SAIDs）的典型特征。

目前已有三种IL-1阻断生物制剂（阿那白滞素、利洛纳塞特和卡那单抗）获批用于临床，通过抑制IL-1信号传导这一NLRP3炎症小体激活的关键下游介质来减轻全身炎症。然而，这些疗法存在显著临床挑战：药物费用高昂导致可及性问题；大量CAPS及相关自身炎症综合征患者仅获得部分或短暂应答，部分患者甚至无应答；长期使用还面临注射负担、药代动力学变异以及抗药抗体导致的疗效丧失。这些局限性反映了机制上的脱节——IL-1阻断并未直接针对NLRP3炎症小体的上游失调，仅非选择性抑制下游炎症介质。因此，亟需靶向炎症小体通路近端组分（如NLRP3）的下一代干预策略。

RNA干扰（RNAi）已成为选择性沉默炎症小体相关转录本（尤其是NLRP3）的有前景的治疗方法。治疗性小干扰RNA（siRNA）已彻底改变了肝脏疾病的治疗格局，但siRNA易被核酸酶快速降解、免疫细胞摄取效率低、内涵体逃逸困难，严重限制了其生物利用度和细胞内疗效。传统递送平台如脂质纳米颗粒（LNPs）可能无意中触发先天免疫应答，包括IL-1β释放，加剧炎症风险。聚合物纳米载体作为LNPs的有前景替代方案应运而生。研究人员此前开发的脂质修饰低分子量聚乙烯亚胺（PEI-C）脂聚合物，兼具良好生物相容性和高效核酸递送能力。基于此，研究人员假设PEI-C配制的LPNPs可作为靶向Nlrp3/NLRP3的siRNA有效递送平台，增强免疫细胞内的摄取和基因沉默，从而减少炎症小体介导的促炎细胞因子IL-1β释放，克服现有IL-1阻断疗法的局限性。

二、主要关键技术方法

研究人员首先利用流式细胞术和共聚焦显微镜评估PEI-C介导的FAM标记siRNA在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的递送效率。随后，在LPS刺激的RAW 264.7细胞和人外周血单个核细胞（PBMCs）中，通过实时定量PCR（RT-qPCR）评估三种靶向Nlrp3（小鼠）和三种靶向NLRP3（人）的siRNA序列的基因敲低效率，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量IL-1β分泌水平。在体内实验中，研究人员选用BALB/c小鼠（n=5），通过静脉注射给予负载CsiRNA或siNlrp3_3的LPNPs（siRNA剂量1 mg kg^-1），20小时后腹腔注射LPS（3 mg kg^-1）激活Nlrp3炎症小体，24小时后处死小鼠并收集肝、肺、脾、心、肾和骨髓等器官进行IL-1β定量。离体验证实验中，研究人员从加拿大血液服务中心获取15名健康志愿者的外周血样本，通过Ficoll-Paque密度梯度离心分离PBMCs，经LPS刺激3小时后转染PEI-C/siNLRP3_3 LPNPs，24小时后ELISA检测IL-1β水平。

三、研究结果

1. PEI-C介导的siRNA高效递送至巨噬细胞

流式细胞术分析显示，PEI-C/FAM-siRNA LPNPs处理RAW 264.7细胞24小时后，与未处理对照相比出现显著荧光偏移，定量确认了广泛而稳健的细胞内siRNA递送，而单独暴露于siRNA或PEI-C的细胞未见此现象。共聚焦显微镜进一步提供了siRNA内化的空间确认，显示LPNP处理细胞胞质内分布有明亮点状和弥散绿色荧光，未处理细胞无检测到荧光。这表明PEI-C能够克服巨噬细胞固有的核酸传感能力，实现高效siRNA递送。

2. 序列依赖性Nlrp3/NLRP3沉默减少IL-1β释放

在小鼠RAW 264.7巨噬细胞中，RT-qPCR分析显示siNlrp3_1和siNlrp3_3相对于CsiRNA诱导了Nlrp3 mRNA的显著抑制，而siNlrp3_2仅实现适度敲低。有趣的是，所有三种siNlrp3序列均显著降低IL-1β分泌，其中siNlrp3_3在基因表达和细胞因子释放两方面均产生最显著降低。在人PBMCs的平行研究中，siNLRP3_1和siNLRP3_3显著减少NLRP3转录本丰度，siNLRP3_2仅显示有限沉默效果。与小鼠数据一致，所有三种siNLRP3序列均显著减弱LPS诱导的IL-1β释放，siNLRP3_3在两个读数中均表现最优。基于这些发现，研究人员选择siNlrp3_3/siNLRP3_3作为后续研究的先导候选。

3. 全身递送PEI-C/siNlrp3_3 LPNPs减弱LPS诱导炎症小鼠模型的IL-1β分泌

在BALB/c小鼠模型中，静脉注射siNlrp3_3 LPNPs后，小鼠在多个组织中表现出IL-1β分泌减少的一致趋势。最显著的IL-1β降低出现在肺（p = 0.0079）和脾（p = 0.0159），这两个器官以高免疫细胞密度和对全身LPS刺激的强响应性为特征。肝和骨髓中也观察到IL-1β水平的适度降低，但未达到统计学显著性。相比之下，心和肾中的IL-1β水平保持不变，提示这些器官中LPNP积累极少或对全身IL-1β产生贡献较低。

4. PEI-C介导的人PBMCs中NLRP3沉默减少IL-1β分泌

在15名健康供体的离体研究中，LPS刺激单独显著增加IL-1β分泌，确认了有效的炎症小体激活。CsiRNA LPNPs转染未降低IL-1β水平，表明观察到的效应与纳米颗粒暴露无关。相比之下，通过PEI-C LPNPs递送siNLRP3_3在60%的样本（n = 9/15，p = 0.0107）中显著抑制了IL-1β分泌，证明了PEI-C/siNLRP3_3在人原代免疫细胞中的整体有效性。然而，剩余40%的供体仅显示最小或无响应，表明存在显著的个体间变异性。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究提供了脂聚合物介导的NLRP3靶向可作为调节炎症轴的精准策略的首个证据。与目前临床测试的小分子抑制剂不同，siRNA方法旨在消除中心炎症小体蛋白的合成，可能产生更持久的治疗效果。研究人员通过筛选小型siRNA文库，为每个物种确定了一个先导候选：小鼠的siNlrp3_3和人的siNLRP3_3，它们在转录本敲低和IL-1β分泌抑制方面均表现最强。全身给予siNlrp3_3 LPNPs在免疫细胞密集器官中有效减少IL-1β产生，而来自健康供体PBMCs的离体研究证实了转化效用。这些结果为PEI-C配制的LPNPs作为肝外siRNA治疗剂用于沉默NLRP3的多功能性提供了有力证据。

讨论也承认了研究的局限性：未评估NLRP3-ASC复合物形成、IL-18分泌和caspase-1裂解动力学等NLRP3炎症小体的关键组分；未直接测量NLRP3蛋白水平；急性内毒素血症模型不能完全模拟慢性或疾病特异性炎症环境；PBMCs的异质细胞组成可能引入变异性；供体间IL-1β反应的异质性可能反映影响NLRP3表达或激活阈值的遗传背景差异，但未进行供体基因分型。

结论：本研究提供了强有力的概念验证证据，支持PEI-C配制的LPNPs作为靶向沉默Nlrp3/NLRP3的有效平台。研究人员成功解决了靶向免疫细胞的核酸治疗中的一个关键挑战。数据显示PEI-C LPNPs实现了NLRP3敲低并显著减少IL-1β分泌。这些发现证明了该平台在IL-1β驱动的炎症性疾病中进行精准RNAi干预的潜力，并为未来涉及患者来源样本、慢性疾病模型和先进人器官样系统的研究奠定了基础。