BnFAD2.A5与BnFAD2·C5在脱饱和能力上的差异机制分析——这种差异导致油菜（Brassica napus）中油酸含量的不同

《Plant Gene》：Mechanistic analysis of differences between the desaturation ability of BnFAD2.A5 and BnFAD2·C5 that lead to different contents of oleic acid in Brassica napus

　　**摘要**

FAD2在脂肪酸代谢过程中起着关键作用。已知BnFAD2.A5和BnFAD2·C5对油菜（Brassica napus）中的油酸含量有显著贡献。我们之前的研究发现，BnFAD2.A5的mRNA表达水平低于BnFAD2.C5，而BnFAD2.A5蛋白的饱和度降低能力优于BnFAD2.C5蛋白；造成这种差异的具体原因尚未阐明。在当前的研究中，我们发现BnFAD2·C5的非编码序列具有比BnFAD2.A5更强的降低油酸的能力（p < 0.05）；这一发现与mRNA表达谱一致。为了探讨非编码序列如何导致功能差异，我们进行了microRNA（miRNA）分析，因为已知miRNA可以作用于非编码区域来调节基因表达。我们发现miR156b（以及miR156c、miR156g）和miR6034能够降低BnFAD2.A5的mRNA表达水平。我们还发现，BnFAD2.A5蛋白的CDS序列表现出比BnFAD2·C5更强的饱和度降低能力（p < 0.05）。为了研究CDS如何导致这种功能差异，我们分析了BnFAD2·C5和BnFAD2.A5的氨基酸序列，并识别出不同的磷酸化位点。通过突变三个位点并将其转入拟南芥，我们发现BnFAD2·C5中第20位的苏氨酸磷酸化作用比第240位的酪氨酸和第246位的缬氨酸更为显著。我们的发现为研究油酸代谢的调控途径提供了理论基础。

**引言**

油菜（Brassica napus）属于十字花科，是世界上最重要的油料作物之一。中国是油菜的最大生产国之一，油菜油是植物油的主要来源。油菜油富含多种脂肪酸，包括油酸、亚油酸和亚麻酸。腌制中国白菜籽油因其高油含量、抗氧化性强、保质期长以及对人体营养价值高等优点而受到育种者的青睐（Cao等人，2020；López等人，2022；Terés等人，2008）。α-亚麻酸（ALA）是人体必需的脂肪酸；最近的研究发现，油菜中的ω-3脂肪酸富含ALA，这些脂肪酸对认知障碍和心血管疾病的危险因素具有有益影响。此外，ALA浓度的增加可以提高种子的油含量（Li等人，2019；Zhang等人，2021）。这些发现对于培育高质量油菜油和高油含量油菜品种具有重要意义。

油酸是脂肪酸代谢途径中多种脂肪酸的前体。脂肪酸去饱和酶2（FAD2）催化油酸（OA）的ω-6/Δ-12去饱和反应生成亚油酸（LA），而脂肪酸去饱和酶3（FAD3）催化亚油酸（LA）的ω-3/Δ-15去饱和反应生成α-亚麻酸（ALA）。因此，FAD2是一种关键蛋白，因为它可以促进油酸水平的提高并增加亚麻酸的含量。脂肪酸去饱和酶基因（FAD2）编码位于内质网上的油酸脱氢酶。该基因最初通过T-DNA标记技术从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆出来（Okuley等人，1994），其功能已在酵母（Pirtle等人，2002）和油菜（Stoutjesdijk等人，2001）中进行研究。在作物育种实验中，Okuzaki等人（2018）使用CRISPR-cas9编辑了BnFAD2-Aa目标基因，并观察到所得植株中的油酸含量相对较高；油酸的比例从野生型的74.6%增加到编辑后的80.0%。随后，Huang等人（2020）利用CRISPR-cas9系统对多个BnFAD2基因拷贝进行编辑，进一步提高了种子中的油酸含量（75.0–80.0%），尽管只有两个品系的油酸含量超过80.0%。然而，这种多重修改为何仅产生两个油酸含量超过80%的品系的具体原因仍不清楚。在后续研究中，Liu等人（2022）进行了单点编辑，发现A5拷贝的突变籽油中油酸与其他脂肪酸的相对比例显著高于C5拷贝，但仍低于80%。然而，使用CRISPR/Cas9系统对BnFAD2的A5和C5拷贝进行双点编辑后，油菜籽油中的油酸含量显著增加，相对比例超过85%（Liu等人，2022）。

其他研究表明，FAD2基因的调控不仅发生在基因水平，还在植物生长和发育过程中发生在蛋白质水平上。在大豆中鉴定出两种不同的FAD2–1形式：FAD2–1A和FAD2–1B；此外，FAD2–1A的稳定性不如FAD2–1B（Tang等人，2005）。此外，研究人员还检测到FAD2–1A序列中第185位serine的磷酸化，并表明这种磷酸化会降低酵母中的酶活性（Kishore等人，2007）。利用蛋白质组学分析研究系统性磷酸化有助于我们理解油菜的生物调控机制；然而，目前关于油菜中BnFAD2蛋白磷酸化的研究还非常有限。

近年来，研究发现miRNA对植物的生长和发育具有重要意义（Jones-Rhoades等人，2006）。例如，miR156、miR397、miR396和miR408都参与种子发育的调控（Huang等人，2013）。此外，还发现了与脂肪酸生物合成相关的特定miRNA。例如，Bna-miR156b、Bna-miR156g、Bna-miR159、Bna-miR395b、Bna-miR6029以及19种新的miRNA参与了脂肪酸生物合成（Li等人，2018；Wang等人，2016）。研究人员发现Lus-miR156a在亚麻籽中的脂肪酸合成中起重要作用（Zhang等人，2020）。因此，研究miRNA在脂肪酸合成过程中的功能非常重要。miRNA可以通过完全结合特定目标基因或部分结合目标基因来切割目标mRNA，从而抑制基因翻译，实现转录后调控。最近的研究发现，miRNA还可以结合增强子，激活增强子，并促进邻近基因的转录（Suzuki等人，2017；Xiao等人，2017）。许多研究人员探索了miRNA编辑技术，并发现将miRNA的生物感应能力与CRISPR的强大编辑功能相结合是一个有前途的方向。Garcia-Guerra等人（2025）设计了一种动态引导RNA，可以感应miRNA来调节CRISPR的编辑活性，在杜兴肌营养不良症小鼠模型中实现了肌肉特异性基因编辑的激活。Hu等人（2025）使用细胞内核苷酸水平的miRNA作为“开关”，在特定细胞中控制CRISPR系统的激活，实现了细胞或组织特异性基因编辑，大大提高了准确性和安全性，并减少了脱靶效应。因此，miRNA编辑技术在安全性方面优于传统的DNA编辑方法（如CRISPR-Cas9），两者的结合可以实现更精确和安全的基因调控。

先前的研究表明，位于A5染色体上的FAD2基因在油菜中油的饱和度降低过程中起主要作用。然而，在我们的实验室中，我们之前发现位于C5染色体上的FAD2基因的mRNA表达水平高于A5染色体上的基因（Liu等人，2018）。然而，尽管BnFAD2.A5的饱和度降低能力优于BnFAD2·C5，但尚未有研究能够确定导致BnFAD2.A5 mRNA表达水平较低的具体机制。在当前的研究中，我们旨在揭示这一现象背后的机制。为此，我们首先在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和拟南芥（Arabidopsis thalina）中分析了BnFAD2.A5和BnFAD2·C5的功能，以验证蛋白质活性的差异。接下来，我们重点研究了蛋白质修饰和转录后调控，特别是miRNA的作用。我们探讨了为什么BnFAD2.A5在mRNA水平上的表达较低但其饱和度降低能力较强，以及为什么BnFAD2·C5在mRNA水平上的表达较高但其饱和度降低能力较弱。总的来说，我们的发现为研究油酸代谢的调控途径提供了理论基础。

**材料**

在田间种植了Xiangyou15品种的油菜（Brassica napus），而在培养箱（BINDER，德国）中培养了FAD2基因被敲除的拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体，光照周期为16/8小时[光照（24°C）/黑暗（22°C]。

**分析**

在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分析了BnFAD2.A5和BnFAD2·C5的饱和度降低能力。将BnFAD2.A5和BnFAD2·C5的编码序列（CDS）克隆到pYES2.0载体中，并在N端插入了人流感血凝素（HA）。然后将得到的构建体转入酿酒酵母INVSC1中。

**酵母中的BnFAD2.A5和BnFAD2·C5活性**

将BnFAD2.A5 CDS和BnFAD2·C5 CDS转入带有N端HA标签的酿酒酵母INVSC1中。接着，我们从含有BnFAD2.A5和BnFAD2·C5蛋白的S. cerevisiae内质网（ER）中提取了微粒体。我们确保反应时间、温度、微粒体蛋白总量和底物浓度一致，并使用标记有13C的油酸CoA作为底物来检测BnFAD2蛋白酶的活性。

**讨论**

油菜油在精炼油市场中占据重要地位，因此有很多关于育种高油酸含量油菜的研究正在进行中。然而，关于调控脂肪酸合成途径的分子机制知之甚少。在之前的研究中，数量性状位点（QTL）定位表明，控制油酸含量的主要QTL位于油菜（B. napus）的A5 linkage group上。

**结论**

总之，我们的分析显示BnFAD2.A5和BnFAD2·C5蛋白表现出相似的活性水平。此外，我们的发现表明，由于第20位氨基酸的磷酸化抑制了其功能表现，BnFAD2·C5的饱和度降低能力较弱。我们还发现BnFAD2·C5的mRNA水平高于BnFAD2.A5；这是由于BnFAD2.A5上存在miR156b/c/g结合位点，该位点促进了mRNA的降解。

**作者贡献声明**

Fang Liu：撰写——原始草稿、数据管理、概念构思。Ruiyang Liu：数据管理、概念构思。Hao He：资金获取。Mei Guan：项目管理、方法学。Chunyun Guan：资金获取。Xiaohua Hao：撰写——审阅与编辑、资金获取。

**资助**

本研究得到了中国国家自然科学基金[资助编号2071930]、中国湖南省自然科学基金[资助编号2022J40288]以及湖南艺术学院校内项目[资助编号23YB02]的支持。

**利益冲突声明**

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所报道的工作。

**致谢**

作者感谢EditSprings（https://www.editsprings.cn）提供的专业语言服务。