苦荞（Fagopyrum tataricum）子叶大小品种冷与UV-B胁迫下植物激素信号转录重编程：MEcoral4模块与FtPYL4耐冷功能

《Plant Physiology and Biochemistry》：Tartary Buckwheat Cotyledon Size Varieties Undergo Distinct Transcriptional Reprogramming of Phytohormone Signaling Under Cold and UV Stresses

　　

苦荞子叶大小受遗传-环境互作和表皮细胞性状影响，并与幼苗表现及冷/UV-B耐受性相关；小粒子叶种质表现出增强的活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除能力和降低的膜损伤。富含激素信号转导的共表达模块MEcoral4将子叶形态与非生物胁迫适应联系起来。枢纽基因FtAUX22D、FtARG7和FtPYL4在小粒子叶种质中诱导更强，且FtPYL4在酵母中赋予耐冷性。冷胁迫和UV-B胁迫触发生长素（auxin）相关代谢物、水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）的基因型特异性重编程，揭示苦荞中子叶大小依赖的胁迫响应背后的植物激素机制。

幼苗期是植物生命周期中最脆弱阶段。子叶作为首个光合器官，为种子萌发和幼苗生长提供氮、碳和能量等营养；健康完整子叶可增强植物对病害、虫害及多种非生物胁迫的抗性，储藏营养影响幼苗建成与生长潜力。然而，在包括苦荞（Fagopyrum tataricum，TB）在内的大多数作物中，子叶大小与非生物胁迫抗性之间的关联及其调控框架尚不清楚。TB起源于中国高海拔喜马拉雅地区，富含芦丁、槲皮素、山奈酚等生物活性物质，种子氨基酸组成均衡，是功能食品开发的重要原料；随着种质资源交流，TB被引种至内陆，亟需提高非生物胁迫适应性。种子萌发中，淀粉降解、α-淀粉酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白及活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除系统等生理生化指标是作物适应逆境的重要机制，并受复杂分子网络调控。转录组分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）可快速识别非生物胁迫相关候选基因。TB原生环境使紫外和冷胁迫研究成为焦点，但子叶大小与种子萌发及其在非生物胁迫适应中的具体作用仍待探索。因此，研究人员评价279份TB种质子叶大小，选取两个代表性品种，研究子叶大小与萌发期生理生化指标关系，并开展冷和UV-B胁迫实验；通过转录组测序鉴定3个可能与植物激素信号转导互作的候选基因。该研究为理解TB子叶响应非生物胁迫的分子机制提供理论基础，为改良和利用优良TB品种及筛选胁迫适应品种提供依据。
主要关键技术方法概括：研究人员从中国主要TB栽培区收集279份种质，在山西省大同、岢岚、太谷3个地点于2022—2023年两年种植，调查子叶面积、高、宽并进行高光谱成像，计算广义遗传力并聚类；选取Ft104（大子叶）和Ft32（小粒子叶）等材料。关键技术包括种子萌发和幼苗期生理生化测定、冷（4°C）与UV-B（30 μW/cm^-2）胁迫处理、转录组测序与差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析、GO和KEGG富集、WGCNA、qRT-PCR验证、靶向LC-MS/MS定量内源激素以及酵母异源表达。
结果部分：
基于子叶大小对TB品种进行分类：研究人员对279份TB资源在3个生态区两年种植，测定子叶面积（cotyledon area，CA）、子叶高（cotyledon height，CH）、子叶宽（cotyledon width，CW）。CA平均为46.34—79.20 mm²，变异系数为17.60%—24.79%；CA与CH、CW显著正相关（r=0.96和0.94，P<0.001）。广义遗传力分别为0.48、0.46和0.50，均小于0.5，说明这些性状受遗传和环境共同调控且环境效应较大。按隶属函数D值分为小粒子叶组22份、中粒子叶组203份、大粒子叶组54份，选取Ft104（大子叶）和Ft32（小粒子叶）。细胞计数显示小粒子叶种质单位面积细胞数显著多于大粒子叶约50个，子叶大小主要由细胞大小和密度决定。
子叶大小与种子萌发呈负相关：吸水速率在0—10 min增加最明显，约16.5 h达峰；Ft32出苗能力显著高于Ft104。S0至S5生理生化测定显示，淀粉含量急剧下降，Ft104从540.21降至16.42 mg/g（96.96%），Ft32从687.13降至27.67 mg/g（95.97%）；α-淀粉酶活性在S3达峰（Ft104为5.16 U/g，Ft32为4.17 U/g，P<0.01），与S0—S3淀粉含量负相关；可溶性糖在Ft32持续下降95.09%，Ft104在S3后下降较慢，总降89.22%；可溶性蛋白在S4最低后略升，总降超过75%。小粒子叶Ft32出苗更强，归因于较高吸水速率、较慢储备消耗和更协调的α-淀粉酶活性。
小粒和大粒子叶品种在冷和UV胁迫下响应不同：小粒子叶组（Ft32、Ft40、Ft130、Ft177、Ft229）和大粒子叶组（Ft80、Ft90、Ft104、Ft123、Ft285）在冷和UV-B胁迫下均出现时间依赖的丙二醛（malondialdehyde，MDA）增加，大粒子叶积累更明显：冷12 h时大粒子叶MDA为44.23±0.87 μmol/g FW，是小粒子叶33.13±0.89 μmol/g FW的1.34倍；UV-B 8 h时大粒子叶为41.14±0.66 μmol/g FW，是小粒子叶31.01±1.07 μmol/g FW的1.33倍。过氧化物酶（peroxidase，POD）活性持续升高且小粒子叶更高；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在冷6 h时小粒子叶为138.16±4.42 U/g FW，大粒子叶为106.14±2.88 U/g FW；UV-B 8 h时小粒子叶SOD为200.8±5.37 U/g FW，为大粒子叶62.329±2.051 U/g FW的3.22倍；过氧化氢酶（catalase，CAT）在冷12 h和UV-B 8 h小粒子叶更高。结果表明，小粒子叶TB品种通过更有效上调抗氧化酶活性和减少MDA积累，对UV-B和冷胁迫更耐受。
Ft32和Ft104在冷和UV胁迫下的转录组分析：24个样本产生153.48 Gb高质量数据，Q30碱基百分比超过92%。冷胁迫0 h至12 h在Ft104诱导4322个DEGs，其中61.08%上调、38.92%下调；UV-B 0 h至8 h在Ft104鉴定3731个DEGs，包括1825个上调和1906个下调基因。与Ft32相比，冷和UV-B胁迫下Ft104分别有3115和3282个DEGs。冷和UV-B共有DEGs分别为758和750个；同一胁迫时间点Ft32与Ft104比较，C12h有5710个DEGs，U8h有4769个DEGs。说明小粒和大粒子叶品种在非生物胁迫下基因表达模式差异显著。
冷和UV胁迫条件下的差异表达基因分析：Venn和KO富集分析显示，UV-B胁迫下三种比较中有311个共有上调、439个共有下调核心DEGs；Ft104品种特异DEGs为1271个，多于Ft32的801个，品种间特异DEGs为568个，说明大粒子叶品种转录响应更广泛。冷胁迫下共有上调468个、下调290个核心DEGs；Ft32品种特异DEGs为862个，略多于Ft104的858个，品种间特异DEGs为874个，提示小粒子叶品种基因响应更强。KEGG富集显示，两个品种DEGs均显著富集于黄酮生物合成、植物MAPK信号、激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等保守胁迫相关通路；UV-B还诱导谷胱甘肽代谢等抗氧化通路，冷胁迫触发α-亚麻酸代谢和玉米素生物合成。
WGCNA和KEGG分析提示Ft32与Ft104植物激素信号重编程不同：WGCNA鉴定18个共表达模块。MEcoral4模块与叶面积（r=0.65）、叶宽（r=0.63）、SOD（r=0.67）、CAT（r=0.64）和MDA（r=0.65）显著正相关，提示其在子叶形态发生和胁迫响应中的核心作用。KEGG富集显示，MEcoral4基因显著富集于植物激素信号转导（24个基因）、植物-病原互作和mRNA监视通路。GS-MM相关分析显示MMcoral4与叶面积、SOD和MDA等性状的GS强正相关。核心枢纽基因FtAUX22D、FtARG7和FtPYL4与目标性状密切关联。MEcoral4中24个基因注释到植物激素信号转导（ko04075），涉及生长素分支（Aux/IAA抑制因子、ARF、GH3、SAUR/ARG7成员）、油菜素内酯、茉莉酸、脱落酸（abscisic acid，ABA）分支（PYL受体FtPYL4和ABF/bZIP）、水杨酸（TGA）和乙烯（ERF1）分支；FtAUX22D与ARF3共表达，而FtPYL4下游的clade-A PP2C磷酸酶和SnRK2激酶不在MEcoral4中，提示受体特异性而非全级联共调控。因此，ABA和生长素信号通路可能参与该过程。
关键植物激素基因差异表达与qRT-PCR验证：qRT-PCR表明，FtARG7、FtAUX22D和FtPYL4在UV-B和冷胁迫下均受诱导，且在小粒子叶品种中倍数更高；UV-B下小粒子叶品种枢纽基因平均上调8—12倍，大粒子叶品种仅3—5倍；冷胁迫下小粒子叶品种上调6—10倍，大粒子叶品种为2—4倍。FtAUX22D在两种胁迫下均持续高于大粒子叶品种，提示其参与胁迫响应。该表达差异与子叶大小表型和耐逆能力高度耦合，说明MEcoral4相关转录响应在小粒子叶种质中更明显，为解析TB子叶大小与抗逆权衡调控框架提供核心候选基因。此外，研究人员进行酵母异源表达初步功能验证：非胁迫下Mock、FtARG7表达和FtPYL4表达酵母生长相当；4°C冷胁迫12 h后酵母活力整体降低，但表达FtPYL4的酵母存活能力明显更强，在10^-3和10^-4稀释点仍可见菌落；表达FtARG7的酵母相对Mock无明显生长优势；4 h UV-B照射导致所有酵母完全致死，无法评价UV-B相关表型。
LC-MS/MS分析揭示Ft32和Ft104在冷和UV-B胁迫下不同的内源植物激素模式：研究人员对Ft32和Ft104在对照、冷6 h/12 h和UV-B 4 h/8 h处理下进行靶向LC-MS/MS定量。非胁迫下两基因型游离IAA水平相当；冷12 h时Ft32游离IAA显著升高，而Ft104下降。生长素合成中间体IAM在冷12 h仅在Ft32积累，Ft104在全部处理中保持低而稳定；生长素分解产物3-ICA在所有条件下Ft32均高于Ft104，显示组成型差异。UV-B未诱导这三种生长素相关代谢物明显积累。ABA在冷胁迫下两材料均积累，存在中等基因型差异；大粒子叶Ft104在UV-B下出现显著JA爆发；SA在冷和UV-B下均逐渐诱导，Ft32保持较高浓度。总体表明，小粒子叶Ft32在冷胁迫下发生明显的生长素代谢稳态重构，并伴随其他防御相关植物激素变化，可能促成Ft32与Ft104不同的非生物胁迫适应表型。
讨论部分总结：原研究讨论认为，子叶或种子大小通常与种子活力正相关，因其储藏物质支持萌发；但本研究中观察到小粒子叶Ft32生理指标变化率较低且出苗能力更高，原文提出这可能是较小粒子叶与资源利用策略相关的可能解释，但需在更广泛种质和生态梯度中验证。生理指标方面，冷和紫外胁迫主要与ROS损伤和修复相关；本研究中可溶性蛋白和可溶性糖先增后降，Ft32可溶性糖积累更快且含量更高、MDA更低，说明其渗透调节能力更强、膜损伤更小；POD、SOD和CAT活性更高进一步证实Ft32具有更强ROS清除能力，这与其小细胞、高密度结构可能减少胁迫损伤的细胞学观察一致。候选基因方面，WGCNA提示候选基因可能与bHLH、MYB、WRKY和ERF等转录因子互作，调控糖酵解/糖异生、苯丙烷生物合成和植物激素信号转导通路。MEcoral4中ABA受体FtPYL4及下游ABF/bZIP存在，但clade-A PP2C和SnRK2不在模块内，提示不同PYL受体可能参与不同ABA调控回路，FtPYL4可能通过受体特异、环境依赖的ABA途径发挥作用。酵母中FtPYL4增强冷存活，与PYL家族ABA受体参与非生物胁迫适应的既往认识一致；FtARG7无显著保护，可能因Aux/IAA抑制因子需要植物特异互作伙伴如ARF，而酵母中缺失；FtAUX22D克隆失败未能测试。原文强调酵母为简化单基因体系，仍需在TB中进行遗传操作解析枢纽基因功能。激素重编程方面，原文认为不能简化为生长素-ABA拮抗，而涉及前体水平和跨家族串扰；IAM经AMI1代谢可作为信号中间体耦合生长素稳态与ABA依赖胁迫响应。MEcoral4中FtAUX22D与ARF及FtPYL4/ABF共表达，提示冷和UV-B下ABA介导胁迫诱导时，可能通过生长素前体来源信号协调下调生长素响应生长基因。LC-MS/MS显示Ft32在冷和UV-B下积累更高IAM、ICA和SA，Ft104则出现UV-B触发JA爆发和一般较高ABA，联合WGCNA、KEGG、qRT-PCR支持两材料间基因型依赖的植物激素重编程。原文也指出局限：主转录组比较每种子叶表型仅选一个代表性材料，部分DEGs可能反映固有遗传背景差异；虽用每种表型5份材料qRT-PCR验证，但缺乏表型内基因型重复，限制将转录组特征推广至所有小粒或大粒子叶种质，未来需增加对比TB材料以去除背景噪声并发现保守模块。
结论翻译：本研究支持TB子叶大小与表皮细胞大小和密度变异相关，并受遗传和环境因素共同影响。小粒子叶种质表现出更强出苗能力以及在低温和UV-B胁迫下更好的耐受性，具更活跃的抗氧化系统和更少膜损伤。转录组和WGCNA分析揭示，富含植物激素信号转导的MEcoral4模块通过转录重编程与子叶大小和胁迫抗性之间的权衡相关。这些发现为培育抗逆TB品种提供了关键候选基因和见解。