《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-Wide Analysis of the R2R3-MYB Family in
Perilla frutescens and the Regulatory Model of the PfMYB33-PfbHLH11 Complex in Anthocyanin Biosynthesis
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矢车菊素型花青素（cyanidin-type anthocyanins）驱动紫苏（Perilla frutescens）叶色变异。全基因组调查在紫苏中鉴定出164个R2R3-MYB基因。PfMYB33作为第6亚组的R2R3-MYB，是重要的紫色叶调控因子。Pf
矢车菊素型花青素（cyanidin-type anthocyanins）驱动紫苏（Perilla frutescens）叶色变异。全基因组调查在紫苏中鉴定出164个R2R3-MYB基因。PfMYB33作为第6亚组的R2R3-MYB，是重要的紫色叶调控因子。PfMYB33与PfbHLH11互作，并表现出双重激活/抑制功能。PfMYB33-PfbHLH11复合物激活DFR2并解除5GT2的抑制。
花青素（anthocyanin）是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于类黄酮家族的重要次生代谢物，具有从橙红到紫蓝的丰富色彩，并参与植物逆境响应与抗氧化防御。紫苏（Perilla frutescens (L.) Britt.）为唇形科一年生草本植物，兼具药用与食用价值，其种质资源丰富，叶片呈现绿色（G）、双面紫色（P）及上绿下紫（GP）等多种稳定表型，是研究植物着色与次生代谢调控的理想材料。已有研究表明，紫苏叶色差异主要取决于花青素的积累水平与组成，主要色素为矢车菊素型花青素，如紫苏素（shisonin）及其丙二酰化衍生物。然而，其生物合成的分子调控机制，特别是关键转录因子在组织特异性色素积累中的功能，至今尚未充分阐明。为此，研究人员开展了本研究，旨在解析不同色泽紫苏品种间花青素变异的转录调控网络。
研究人员整合非靶向代谢组学、花青素靶向代谢组学与转录组学分析，对G、GP、P三种叶色紫苏的叶片进行系统比较，鉴定与花青素积累显著相关的候选基因。在全基因组水平完成紫苏R2R3-MYB基因家族的系统鉴定，共获得164个成员。研究发现，差异表达转录因子PfMYB33与PfbHLH11在紫叶中共表达并发生蛋白互作，二者形成的复合物能够协同激活DFR2（二氢黄酮醇4-还原酶基因），并解除PfMYB33对5GT2（花青素糖基转移酶基因）的转录抑制，从而促进花青素积累。该研究首次揭示了紫苏中MYB-bHLH复合物对花青素合成途径不同节点的双向调控模式，为阐明紫苏叶色多样性的分子机制奠定了理论基础，并为紫苏优质种质分子育种提供了重要依据。
供试三种叶色紫苏种子采购自河北省安国市商业供应商，经南京农业大学朱再标教授鉴定，于标准化温室条件下培养，三个月龄取样，每种表型设三个生物学重复。代谢组学采用非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）与花青素靶向LC-MS/MS；转录组学利用RNA-seq测序并以DESeq2鉴定差异表达基因。R2R3-MYB家族采用HMMER搜索MYB结构域（PF00249）并经CDD复核，系统发育用MEGA 12最大似然法构建。蛋白互作与调控功能验证使用亚细胞定位、酵母双杂交（Y2H）、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶（LUC）报告系统及紫苏子叶瞬时表达。
3.1 非靶向代谢组分析结果
通过比色法定量总花青素和总黄酮含量，发现紫叶含量最高，绿紫叶次之，绿叶最低，其中紫叶花青素含量为3.59 mg/g DW，分别为绿叶和绿紫叶的5.67倍和1.29倍。非靶向LC-MS共鉴定675种次级代谢物，差异代谢物显著富集于“类黄酮生物合成”“黄酮和黄酮醇生物合成”等通路，表明叶色差异与类黄酮代谢密切相关。
3.2 花青素靶向代谢组结果
花青素靶向LC-MS/MS共检出42种黄酮类化合物，其中矢车菊素型花青素占26%，为最丰富类群。紫叶中含量最高的花青素为矢车菊素-3-O-5-O-(6-O-香豆酰基)-二葡萄糖苷（cyanidin-3-O-5-O-(6-O-coumaroyl)-diglucoside），达221.28 μg/g DW。P vs G比较共鉴定27个差异花青素代谢物，其中26个在紫叶中显著上调，证明矢车菊素型花青素的差异积累是叶色差异的主要代谢基础。
3.3 转录组分析结果
RNA-seq共获得61.40 Gb高质量数据，平均比对率为91.38%。差异表达基因（DEG）分析显示，GP vs G、P vs G、P vs GP三组分别有6215、6360、6808个DEGs。GO与KEGG富集分析一致显示这些DEGs显著富集在类黄酮与花青素生物合成以及逆境响应相关通路，与代谢组结果和表型差异高度吻合。
3.4 花青素生物合成途径基因鉴定结果
在转录组水平共鉴定61个编码花青素生物合成关键酶的DEGs，包括PAL、C4H、CHS、DFR、ANS等。表达模式分析显示，上游基因（PAL、4CL）在G和GP叶中高表达，而下游基因（F
3'H、DFR、UGT、AT）在紫叶中显著高表达，说明下游基因表达上调驱动代谢流向花青素合成方向流动。
3.5 R2R3-MYB家族全基因组鉴定及分析结果
利用HMMER搜索与CDD结构域验证，研究人员共鉴定164个PfR2R3-MYB蛋白，按氨基酸长度顺序命名为PfMYB01至PfMYB164。系统发育分析将其与拟南芥R2R3-MYB蛋白划分为32个亚群（C1-C32）。保守基序、基因结构与染色体定位分析表明，同一亚群成员具有相似的序列特征；164个基因不均匀分布于20条染色体上，且存在串联重复事件。顺式作用元件预测显示，光响应元件和茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件最为丰富。
3.6 PfMYB基因表达模式分析结果
转录组表达分析显示，164个PfMYB基因中有141个在至少一种组织中表达，87个在三种叶色中均表达。三组比较共鉴定出140个DEGs，表达聚类将其分为8个簇。其中簇1包含45个基因，在紫叶中近乎特异高表达，提示这些基因可能是花青素合成的正调控候选因子。
3.7 调控花青素合成的PfMYB基因鉴定结果
系统发育分析表明，PfMYB33和PfMYB56与拟南芥第6亚群花青素激活因子（AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113、AtMYB114）聚在一起，而PfMYB82和PfMYB81与拟南芥S5亚群AtMYB123（调控原花青素）聚类。结合表达模式，PfMYB33属于紫叶特异高表达的簇1，且氨基酸序列具有花青素调控型MYB的典型特征基序，因此被确定为紫苏花青素合成的候选关键调控因子。
3.8 PfMYB33与PfbHLH11互作及功能验证结果
亚细胞定位实验显示PfMYB33和PfbHLH11均定位于细胞核。Y2H实验证实二者存在直接蛋白互作。相关性分析表明，两个转录因子的表达水平与13个花青素代谢物和22个花青素合成结构基因呈显著正相关。Y1H实验显示，PfbHLH11结合DFR2与5GT2启动子，而PfMYB33除这两个启动子外还结合C4H2、CHS4、DFR1和ANS5启动子。双LUC实验表明，PfMYB33单独显著激活DFR2启动子活性，与PfbHLH11共表达时激活效应协同增强；PfMYB33单独显著抑制5GT2启动子活性，但与PfbHLH11共表达时抑制被部分解除。紫苏子叶瞬时表达实验进一步证实，共表达PfMYB33与PfbHLH11时花青素积累量最高，单独表达PfMYB33次之。
讨论部分指出，紫苏叶色多样性主要取决于矢车菊素型花青素的差异积累，代谢组与转录组联合分析确认下游结构基因（F
3'H、DFR、UGT等）的表达上调是紫叶花青素大量积累的直接原因。PfMYB33在序列上具有花青素调控型R2R3-MYB的典型特征，属于拟南芥S6亚群，其在紫叶中的特异高表达支持其作为关键上游调控因子的角色。更为重要的是，Y2H、Y1H与双LUC结果共同揭示了PfMYB33-PfbHLH11复合物对花青素途径的精细调控机制：一方面协同激活DFR2，另一方面缓解PfMYB33对5GT2的抑制，形成对代谢途径不同节点的双向调节。这种相反效应可能允许同一复合物在不同代谢分支间协调碳通量，是紫苏叶色多样化的一种精细分子策略。
本研究通过整合代谢组学与转录组学分析，系统研究了G、GP、P三种紫苏叶色变异的代谢和分子基础。结果表明，矢车菊素型花青素的差异积累是驱动叶色梯度形成的首要生化原因。全基因组鉴定共获得164个PfMYB基因，其中与拟南芥第6亚群成员聚类的PfMYB33在紫叶中特异高表达，被确定为紫苏花青素生物合成的关键调控因子。PfMYB33与AtTT8的推定同源物PfbHLH11发生物理互作且共表达，二者共同结合DFR2启动子并协同激活其转录；PfMYB33单独抑制5GT2，而PfbHLH11可部分缓解该抑制。在紫苏子叶中瞬时共表达PfMYB33与PfbHLH11导致最高的花青素积累，证实了该复合物的协同促花青素功能。这一双向调控模式揭示了单个MYB转录因子对花青素途径不同节点施加相反效应的复杂调控逻辑，其bHLH互作伙伴作为共调因子微调靶基因表达，为紫苏花青素生物合成与叶色变异的分子机制提供了新见解。
