《Plant Physiology and Biochemistry》：Comparative Transcriptome analysis reveals coordinated ABA, ROS, MAPK, and hormone-mediated regulatory networks underlying cold tolerance in noni (
Morinda citrifolia L.)
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摘要
海巴戟（Morinda citrifolia L.）是一种广泛栽培于热带和亚热带地区的多年生植物，其果实和叶片因富含抗氧化活性物质而被用于食品、医药及工业产品。然而，冬季低温严重制约了其在海南等亚热带产区的大规模种植。本研究选取耐冷基因型KH-4与冷敏感
摘要
海巴戟（Morinda citrifolia L.）是一种广泛栽培于热带和亚热带地区的多年生植物，其果实和叶片因富含抗氧化活性物质而被用于食品、医药及工业产品。然而，冬季低温严重制约了其在海南等亚热带产区的大规模种植。本研究选取耐冷基因型KH-4与冷敏感基因型SY作为对比材料，整合形态学、生理学、生物化学及比较转录组学分析，以揭示海巴戟耐冷性的分子机制。在5°C低温处理下，KH-4表现出更低的电解质渗漏率（electrolyte leakage, EL）、更高的脯氨酸积累量以及更强的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）活性，表明其具有更强的膜稳定性、渗透调节能力和抗氧化防御能力。转录组测序共鉴定出4286个候选耐冷基因。功能富集分析显示，这些基因显著富集于脱落酸（abscisic acid, ABA）依赖与非依赖信号通路、活性氧（reactive oxygen species, ROS）信号网络、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路以及多种植物激素信号转导途径。值得注意的是，经典的ICE1-CBF通路在海巴戟中未显著激活，而MAPKKK-MKK-MPK-CAMTA3模块可能在耐冷性调控中发挥主导作用。此外，研究人员还筛选出四个与耐冷性高度相关的候选基因，包括编码纤维素合酶、钙调素样蛋白（calmodulin-like protein, CML）、蛋白酶体亚基α及一个功能未知蛋白的基因。本研究首次从比较转录组学角度揭示了海巴戟耐冷性的生理与分子基础，为后续功能验证及耐冷品种分子育种提供了重要基因资源和理论依据。
论文解读
一、研究背景与科学问题
海巴戟（Morinda citrifolia L.）属于茜草科（Rubiaceae）多年生植物，广泛分布于南太平洋岛屿、印度尼西亚、泰国、马来西亚及中国海南等热带和亚热带地区。其叶、果和根因具有抗氧化特性而被广泛应用于食品、医药和工业产品。近年来，消费者对健康食品认知的提升推动了海巴戟产品的需求增长。然而，冬季低温成为限制其规模化种植的主要瓶颈，尤其在海南等亚热带产区。田间观察发现，低于10°C的温度会导致大多数种质严重落叶，约5°C的低温则使大部分种质死亡。相比之下，优良基因型康汉4号（Kanghan-4, KH-4）仅表现出暂时性叶片衰老，随后正常恢复生长，显示出优异的耐冷性。这表明海巴戟种质间存在显著的耐冷性遗传变异，开发耐低温品种对于可持续生产和地理扩展至关重要。尽管KH-4通过长期育种被确认为宝贵的耐冷资源，但其优越冷适应性的分子机制仍不清楚。因此，本研究旨在通过整合形态学、生理学、生物化学及比较转录组学分析，阐明海巴戟耐冷性的分子调控机制。
二、研究方法概述
研究人员选取耐冷基因型KH-4和冷敏感基因型三亚（Sanya, SY）作为对比材料。将6月龄幼苗置于5°C、12小时光照/12小时黑暗、相对湿度80%的生长箱中进行冷胁迫处理，分别处理0、4、8、16和24小时，随后恢复至室温24小时并在30°C下恢复2天以评估形态表型。对于RNA测序，采集0、4和8小时时间点的叶片样品，每个时间点设置三个生物学重复，共计18个样品。利用Illumina HiSeq 2500平台进行双端150 bp测序，经从头组装获得117,100条unigenes。采用edgeR软件包鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），筛选标准为q值≤0.05且倍数变化≥2。通过GO和KEGG富集分析对DEGs进行功能注释。同时测定相对电解质渗漏率（relative electrolyte leakage, REL）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量、脯氨酸含量以及SOD、POD和CAT活性。此外，选取20个候选基因通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）验证转录组数据的可靠性。
三、研究结果
3.1 冷处理的形态学效应
冷胁迫诱导了两种基因型的形态损伤。SY在冷处理8小时后下部叶片出现暗绿色变色，16小时后所有叶片变软脱落，24小时后叶脉变黑。而KH-4仅有个别叶片出现少量水渍状病斑，其余叶片保持正常形态。恢复后，SY幼苗严重萎蔫坏死且无法恢复，而KH-4恢复正常生长并保持旺盛发育。
3.2 电解质渗漏、脂质过氧化与脯氨酸积累
对照条件下，SY的REL（32.30%）高于KH-4（23.37%）。冷胁迫使SY的REL显著升高至40.67%，而KH-4仅小幅升至24.59%。恢复期KH-4的REL降至20.31%，低于对照水平。MDA含量在冷胁迫下两种基因型均增加，但KH-4在恢复期降幅更大。KH-4在对照条件下脯氨酸含量（304.66）显著高于SY（129.92），冷胁迫下虽有所降低但仍维持较高水平（148.55），恢复期进一步累积至498.86。
3.3 抗氧化酶活性
SOD活性在恢复期显著升高，KH-4（19.99）远高于SY（8.87）。POD活性在冷胁迫下两种基因型均降低，但KH-4维持较高水平。CAT活性在冷胁迫下SY降低而KH-4显著升高，恢复期KH-4仍维持更高活性。
3.4 转录组测序与DEGs鉴定
18个文库共获得910,867,496条原始读段，经质控后保留874,590,127条干净读段（96.02%）。从头组装获得117,100条unigenes。KH-4在冷处理4小时后的DEGs数量比SY多1,025个，主要表现为更多上调基因。8小时后两者DEGs总数相近，但KH-4多586个上调基因、少590个下调基因。
3.5 耐冷基因鉴定
通过比较分析共鉴定出4,286个耐冷相关基因。其中4小时处理阶段2,182个，8小时处理阶段3,551个，两个阶段共有1,447个基因持续响应。
3.6 GO与KEGG富集分析
GO分析显示DEGs主要富集于代谢过程、氧化还原过程、磷酸化、转录和光合作用等生物学过程，以及膜组分、细胞核、叶绿体和质膜等细胞组分，催化活性、ATP结合、DNA结合和蛋白激酶活性等分子功能。KEGG分析显著富集到植物激素信号转导、植物-病原互作、次生代谢物生物合成、光合作用、MAPK信号通路和钙信号通路等。
3.7 ABA依赖与非依赖信号通路
共鉴定出16个与ABA信号通路相关的耐冷基因，分属PYL、PP2C、SnRK2、NAC和DREB家族。其中14个基因在KH-4中表达高于SY，包括PYL、SnRK3和DREB家族成员。PP2C家族Contig_23407和NAC家族Contig_40862在KH-4中下调。
3.8 ROS信号网络
共鉴定出53个与ROS信号网络相关的耐冷基因，分属CML、CIPK、CDPK、CTA、ZAT、WRKY、RAV、MDAR、GLR、AOX和PrxR家族。其中52个基因在KH-4中表达高于SY，仅ZAT家族Contig_68068下调。
3.9 MAPK信号通路
共鉴定出13个与MAPK信号通路相关的耐冷基因，分属CAM、CAMTA3、MAPKKK、MKK和MPK家族。所有13个基因均在KH-4中表达高于SY，多数为MAPKKK家族成员。
3.10 植物激素信号通路
共鉴定出21个与植物激素信号转导相关的耐冷基因，涉及生长素、细胞分裂素、赤霉素（GA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）和油菜素内酯（BR）信号通路。生长素信号通路包含最多DEGs。细胞分裂素信号组分AHP（Contig_27881）和赤霉素信号组分GID2在KH-4中下调，而BR信号下游TCH4和JA信号组分COI1与MYC2在KH-4中上调。
3.11 候选耐冷基因
四个候选基因（First_Contig19529编码纤维素合酶、Contig_3485编码CML18、Contig_38164编码蛋白酶体亚基α3、Contig_2712编码功能未知蛋白）在KH-4中表达显著高于SY，其中Contig_2712在冷处理后表达升高近五倍。
四、讨论与结论
本研究表明，海巴戟耐冷性是一个受多基因协同调控的复杂数量性状。KH-4的优越耐冷性与其快速的转录重编程、有效的膜稳定性维持、渗透平衡调节和抗氧化能力密切相关。ABA依赖与非依赖信号通路在KH-4中被更强烈地激活，尤其是PYL、SnRK2和DREB家族成员的显著上调，以及PP2C负调控因子的下调，共同促进了ABA信号的增强。ROS信号网络中钙信号感知元件（CML、CIPK、CDPK）和抗氧化相关蛋白（MDAR、AOX、GLR、PrxR）的广泛上调，与生理层面更高的SOD、POD和CAT活性相吻合，表明KH-4拥有更高效的ROS清除体系。MAPK信号通路中MAPKKK-MKK-MPK-CAMTA3模块的持续激活，而非经典的ICE1-CBF通路，可能是海巴戟耐冷性的主导调控机制。多种植物激素信号通路的协同参与，包括生长素信号增强、细胞分裂素和赤霉素信号抑制、乙烯信号优化以及油菜素内酯和茉莉酸信号的正向调控，共同构成了复杂的激素调控网络。综合而言，本研究首次从比较转录组学角度揭示了海巴戟耐冷性的生理与分子机制，鉴定了4,286个候选耐冷基因，为后续功能验证和分子标记辅助育种提供了重要的基因资源和理论基础。
