《Plant Physiology and Biochemistry》：A PebZIP44–PeHSF12–PeHSP17.8 transcriptional module controls heat shock protein expression and thermotolerance in passion fruit(
Passiflora edulis )
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高温胁迫日益威胁热带及亚热带地区百香果（Passiflora edulis）的产量与品质。热激转录因子（heat shock transcription factor, HSF）是植物热响应过程的核心调控因子，通过结合热激元件（heat shock eleme
高温胁迫日益威胁热带及亚热带地区百香果（Passiflora edulis）的产量与品质。热激转录因子（heat shock transcription factor, HSF）是植物热响应过程的核心调控因子，通过结合热激元件（heat shock element, HSE）激活热激蛋白（heat shock protein, HSP）的表达。然而，HSF在百香果等多年生果树中的功能网络尚不明确。本研究聚焦于热诱导型转录因子PeHSF12，综合运用DAP-seq、凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、双荧光素酶报告系统、异源表达及病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）等技术，系统解析了其调控机制。研究人员在百香果基因组中鉴定出15个HSF家族成员，其中PeHSF12属于HSFA2亚群，在热胁迫下显著上调表达，且定位于细胞核。在拟南芥中过表达PeHSF12可显著增强植株耐热性，表现为超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性升高、丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量降低及活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累减少；而在百香果中沉默PeHSF12则导致耐热性显著下降。DAP-seq及EMSA证实PeHSF12可直接结合PeHSP17.8启动子中的HSE基序并激活其转录。进一步研究发现，上游转录因子PebZIP44可与PeHSF12启动子结合并与其蛋白互作，负向调控PeHSF12介导的PeHSP17.8转录激活。在高温条件下，PebZIP44表达下调，解除其对PeHSF12的抑制，从而启动下游热响应基因的表达。该研究首次揭示了百香果中PebZIP44–PeHSF12–PeHSP17.8协同转录调控模块，为解析植物耐热性调控网络提供了新见解。
论文解读
一、研究背景与科学问题
百香果（Passiflora edulis）是热带和亚热带地区重要的高价值经济作物。随着全球气温持续升高，高温胁迫日益成为制约百香果产量和品质的关键因素。热胁迫会加剧落花、降低坐果率，对生产造成严重损失。因此，解析百香果耐热性的分子调控机制，培育耐热品种已成为农业生产的迫切需求。
热激转录因子（HSF）是植物热响应过程的核心调控因子，通过结合靶基因启动子中的保守热激元件（HSE）激活热激蛋白（HSP）的表达。HSF家族依据结构特征分为A、B、C三个亚家族，其中A亚家族成员在多种植物的耐热性调控中发挥主导作用。尽管HSF在拟南芥、水稻、玉米等模式植物中已被深入研究，但在百香果等多年生果树中的功能网络仍不清楚。此前研究虽已在百香果中鉴定出18个HSF基因，但其调控机制及其在胁迫响应通路中的整合方式仍属未知。
在众多植物中，HSFA型因子通常作为主调控因子发挥作用。例如，拟南芥HSFA1在热胁迫下启动转录级联反应，诱导下游HSF表达，并与DREB2A等转录因子协同放大热响应。HSFA2和HSFA3进一步参与获得性耐热性的建立，是多种物种中保守的正调控因子。然而，百香果中是否存在类似的调控层级及其调控方式尚未明确。
基于上述背景，本研究聚焦于百香果中热诱导型转录因子PeHSF12，旨在阐明其在耐热性调控中的功能与分子机制，并解析其上游调控因子与下游靶基因，构建完整的转录调控网络。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过系统的分子生物学与遗传学手段，对PeHSF12的功能进行了全面解析。首先，在百香果基因组中鉴定出15个HSF家族成员，系统命名为PeHSF1至PeHSF15。系统进化分析表明，PeHSF12属于HSFA2亚群，与拟南芥AtHSFA2具有最高的同源性。表达模式分析显示，PeHSF12在正常条件下基础表达水平较低，但在39℃热胁迫下显著上调，表现出强烈的热诱导特性。亚细胞定位实验证实PeHSF12蛋白定位于细胞核，符合其作为转录因子的功能特征。
在功能验证层面，研究人员利用异源表达系统，在拟南芥中过表达PeHSF12。热胁迫处理后，转基因植株表现出显著增强的耐热性：与野生型相比，转基因植株SOD活性提高37%，MDA含量降低约30%，超氧阴离子积累减少，叶片白化表型明显减轻。这些结果表明PeHSF12通过增强活性氧清除能力和维持膜稳定性来提升植物耐热性。由于百香果稳定遗传转化体系尚未建立，研究人员建立了病毒诱导基因沉默（VIGS）系统对PeHSF12进行瞬时沉默。结果表明，PeHSF12沉默植株在高温胁迫下出现叶片卷曲，持续热暴露最终导致植株死亡，存活率显著低于对照组。沉默植株的SOD活性降低67.72%，MDA含量升高47.57%，进一步证实PeHSF12在百香果耐热性中发挥正向调控作用。
在靶基因鉴定方面，研究人员利用异源拟南芥转录组分析筛选保守的热响应候选基因，鉴定出AtHSP17.8（拟南芥中百香果小热激蛋白基因PeHSP17.8的同源基因）受PeHSF12调控。随后通过百香果基因组范围的DAP-seq分析，鉴定出88,635个高置信度的PeHSF12结合位点，其中PeHSP17.8启动子区域存在强结合峰。DAP-seq分析还鉴定出PeHSF12的保守结合基序TTCTAGAANMTTCTA，与典型HSE结构相似。EMSA实验证实PeHSF12可直接结合PeHSP17.8启动子中的HSE基序，双荧光素酶报告系统进一步验证了PeHSF12对PeHSP17.8启动子的转录激活作用。VIGS沉默PeHSF12后，PeHSP17.8表达显著下降，从正反两方面证实了二者的直接调控关系。
在上游调控因子鉴定方面，研究人员通过酵母单杂交（Y1H）和双分子荧光互补（BiFC）实验，证实PebZIP44可直接结合PeHSF12启动子，并与PeHSF12蛋白发生物理互作。双荧光素酶报告实验表明，PebZIP44单独不能激活PeHSP17.8启动子，但与PeHSF12共表达时显著抑制了PeHSF12介导的转录激活活性。表达分析显示，PebZIP44在热胁迫3小时表达下降，恢复正常温度后回升，提示其在高温条件下通过表达下调解除对PeHSF12的抑制。
三、关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：利用HMMER模型和BLASTP从百香果基因组中系统鉴定HSF家族成员，并构建NJ系统进化树分析进化关系；采用qRT-PCR分析基因表达模式；通过GFP融合蛋白瞬时表达观察亚细胞定位；利用农杆菌介导的花序浸蘸法获得PeHSF12过表达拟南芥转基因株系；采用DAP-seq在全基因组范围内鉴定PeHSF12结合位点；利用RNA-seq分析异源拟南芥转录组变化；通过EMSA验证蛋白-DNA直接结合；利用双荧光素酶报告系统检测转录激活活性；采用酵母单杂交和BiFC验证蛋白-DNA及蛋白-蛋白互作；建立并应用VIGS系统在百香果中进行基因功能验证。样本来源包括百香果品种钦果9号（Qinguo No.9）及拟南芥Columbia生态型。
四、研究结果分述
1. 百香果基因组中PeHSF家族的鉴定与进化分析：以拟南芥21个、水稻25个、甘蓝35个HSF蛋白序列为查询序列，从百香果基因组中鉴定出15个HSF家族成员。系统进化分析将96个HSF蛋白分为A、B、C三个簇，百香果分别有9、4、2个成员。PeHSF12属于HSFA2亚群，表现出强烈的热诱导特性，被选为深入研究对象。
2. 热胁迫响应表达与核定位分析：qRT-PCR结果显示大多数PeHSF基因受热胁迫诱导，其中PeHSF12在39℃处理下表现出最强的诱导表达。荧光显微镜观察证实PeHSF12-GFP融合蛋白在烟草叶片细胞中定位于细胞核。
3. 过表达PeHSF12增强拟南芥耐热性：在29℃热胁迫72小时后，野生型拟南芥出现叶片白化表型，而转基因株系形态变化轻微。NBT染色显示转基因植株超氧阴离子积累显著减少，SOD活性提高37%，MDA含量降低，表明PeHSF12过表达通过增强抗氧化能力提升耐热性。
4. 异源转录组分析鉴定保守热响应基因：RNA-seq分析发现39个基因在热胁迫下上调且受PeHSF12正调控，其中AtHSP17.8被鉴定为保守的热响应候选靶基因。GO和KEGG富集分析显示这些基因与离子结合、催化活性及MAPK信号通路相关。
5. VIGS沉默PeHSF12影响百香果耐热性：沉默PeHSF12后，百香果植株在高温下出现叶片卷曲，持续热暴露导致死亡。沉默植株SOD活性降低67.72%，MDA含量升高47.57%，存活率显著下降。qRT-PCR显示PeHSP17.8表达显著降低，提示其可能受PeHSF12直接调控。
6. 全基因组DAP-seq鉴定PeHSF12靶基因：DAP-seq鉴定出88,635个高置信度结合位点，主要富集在转录起始位点下游。结合位点分布包括启动子区4.18%、基因间区87.22%、内含子3.88%和外显子4.71%。PeHSP17.8启动子区域存在强结合峰，被确定为候选靶基因。
7. PeHSP17.8确认为PeHSF12的直接靶基因：DAP-seq鉴定出PeHSF12保守结合基序TTCTAGAANMTTCTA，与典型HSE相似。EMSA证实PeHSF12可直接结合PeHSP17.8启动子中的HSE基序，双荧光素酶实验验证了PeHSF12对PeHSP17.8启动子的转录激活作用。
8. PebZIP44与PeHSF12互作并抑制其转录激活功能：酵母单杂交证实PebZIP44可结合PeHSF12启动子，BiFC证实二者蛋白互作。双荧光素酶实验表明PebZIP44共表达可抑制PeHSF12介导的PeHSP17.8启动子激活。热胁迫下PebZIP44表达下降，恢复正常温度后回升。
五、讨论与结论
讨论部分指出，PeHSF12在百香果耐热性调控中发挥关键作用，其功能在转录和生理两个层面均得到验证。PeHSF12通过直接结合PeHSP17.8启动子中的HSE基序激活其转录，同时受上游因子PebZIP44的负向调控。在高温条件下，PebZIP44表达下调，解除对PeHSF12的抑制，从而启动下游热响应基因的表达，形成多层次的耐热调控网络。该研究首次揭示了百香果中PebZIP44与HSF的协同互作机制，为理解植物耐热性网络的物种特异性适应提供了新见解。
研究结论为：PeHSF12是百香果中关键的热胁迫响应基因，过表达可增强拟南芥耐热性，沉默则降低百香果耐热性。其作用机制为：上游转录因子PebZIP44结合PeHSF12启动子并负向调控其表达，高温下PebZIP44表达下降解除抑制，激活的PeHSF12启动转录级联，诱导PeHSP17.8等胁迫响应基因表达，从而增强百香果耐热性。该PebZIP44–PeHSF12–PeHSP17.8协同转录模块的精确动态调控机制仍需进一步研究。
