《Plant Physiology and Biochemistry》：KNOX-HDAC2 complex suppresses expression of the CAND1 is involved in sporophytic development of
Pyropia yezoensis
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红藻条斑紫菜（Pyropia yezoensis）的PyKNOX属于进化上保守的TALE（three-amino acid loop extension）转录因子家族。PyHDAC2与PyKNOX转录因子相互作用形成转录复合体，该相互作用已在体内（in viv
红藻条斑紫菜（Pyropia yezoensis）的PyKNOX属于进化上保守的TALE（three-amino acid loop extension）转录因子家族。PyHDAC2与PyKNOX转录因子相互作用形成转录复合体，该相互作用已在体内（in vivo）和体外（in vitro）实验中得到验证。PyCAND1是PyKNOX的潜在靶基因，并通过酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）和电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）实验得到验证。
条斑紫菜（Pyropia yezoensis）是中国、韩国和日本重要的经济海藻，其生活史在微观二倍体丝状孢子体（丝状体）与宏观单倍体叶状配子体（叶状体）之间交替。从丝状体到孢子囊枝的转变是世代交替的关键预备阶段，直接决定人工育苗的成功率和最终产量。已有研究显示该过程受温度和光周期等环境信号调控，并伴随全基因组范围的转录重编程，但核心转录调控机制仍不清楚。前期转录组分析提示KNOX基因参与条斑紫菜的世代转换，然而其功能的体外与体内实验验证一直缺乏。该研究旨在解析核心转录因子PyKNOX在孢子体发育中介导的转录调控网络，为理解红藻异型世代交替的分子进化及紫菜育苗提供理论依据。
本研究以采自江苏省东台市紫菜筏架的条斑紫菜纯合品系为材料（该品系经单细胞分离技术建立）。研究人员利用亲和纯化-质谱（affinity purification-mass spectrometry，AP-MS）筛选候选互作蛋白，通过酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和GST pull-down分别验证体内外互作；利用DNA亲和纯化测序（DNA affinity purification sequencing，DAP-seq）全基因组鉴定PyKNOX结合位点；通过酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）和电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）验证靶基因结合；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测关键基因在不同发育阶段的表达；并利用AlphaFold 3进行蛋白复合体和蛋白-DNA复合物的结构预测。
### 3.1 序列特征和进化保守性
研究人员克隆了PyKNOX，其C端含有高度保守的Homeobox_KN结构域。多序列比对显示，DNA结合的关键氨基酸残基在红藻和陆生植物中严格保守。系统发育树显示PyKNOX与红藻同源序列紧密聚簇，尤其与越南紫菜（Pyropia vietnamensis）的亲缘关系最近，表明PyKNOX是一个古老且保守的转录因子。
### 3.2 鉴定PyHDAC2为候选PyKNOX互作蛋白
AP-MS分析发现多个在PyKNOX pull-down组分中特异富集的候选蛋白，其中组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）家族成员PyHDAC2（GenBank登录号KAK1866534.1）显著富集。序列分析显示PyHDAC2含有典型的Arginase_HDAC结构域，且活性位点和金属结合位点保守。系统发育分析表明PyHDAC2与红藻同源蛋白紧密聚簇，具有深度的进化保守性。
### 3.3 PyKNOX与PyHDAC2在体内外直接互作
结构建模和分子对接预测二者形成稳定的相互作用界面。Y2H实验证明PyKNOX与PyHDAC2在酵母细胞内特异性互作；Co-IP实验证明在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时共表达时二者能够共沉淀；GST pull-down实验证明纯化的重组PyHDAC2-GST可直接拉下PyKNOX-His，排除了中间蛋白介导的可能。
### 3.4 全基因组鉴定PyKNOX结合靶标
DAP-seq分析显示，15.4%的PyKNOX结合峰（对应2468个结合位点）位于启动子区。基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析显示靶基因显著富集于“转录抑制复合体”和“SCF泛素连接酶复合体”；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析富集到“内质网蛋白质加工”通路。基序分析鉴定到一个含高度保守“TGAG”和“GACA”核心序列的基序，与植物TALE/KNOX家族转录因子的典型DNA结合偏好一致。
### 3.5 PyKNOX直接靶向并结合PyCAND1启动子
PyCAND1是SCF泛素连接酶复合体的核心成分，被选为主要候选靶基因。结构模拟显示PyKNOX的Homeobox结构域能够嵌入PyCAND1启动子DNA的大沟，并通过精氨酸363、谷氨酰胺393和赖氨酸407等残基形成氢键网络。Y1H实验证明PyKNOX能够结合含194 bp PyCAND1启动子片段的酵母报告菌株，且该结合依赖50 ng/mL金担子素A（Aureobasidin A，AbA）筛选。EMSA实验进一步证明PyKNOX-His可结合含Motif B的生物素标记探针，且未标记的冷探针能够竞争结合。
### 3.6 时空表达模式验证调控网络
RT-qPCR结果显示，PyKNOX和PyHDAC2的转录水平在叶状体（LG）阶段较低，在自由丝状体（FL）中显著上调，并在孢子囊枝（CB）阶段达到峰值；而PyCAND1的表达趋势相反，在从叶状体向丝状体转变过程中被显著抑制，但在孢子囊枝阶段恢复并达到峰值。这种表达相关性支持PyKNOX-PyHDAC2复合体在体内对PyCAND1的负调控关系。
### 讨论总结
讨论部分指出，PyKNOX含有58.65%的内在无序区（intrinsically disordered regions，IDRs），其互作蛋白PyHDAC2同样具有内在无序特征，这种双向结构柔性可能有利于二者在核内动态组装。转录因子通常需要招募共抑制因子（如HDAC）行使功能，拟南芥中HDA15-HFR1、HDA9-WRKY53等已有类似机制。DAP-seq鉴定的基序特征与植物KNOX一致，且靶基因富集于SCF泛素连接酶复合体。CAND1作为SCF复合体的交换因子，在植物发育中具有重要作用。研究人员据此提出工作模型：在二倍体孢子体阶段，高表达的PyKNOX招募PyHDAC2组装转录抑制复合体，直接结合PyCAND1启动子导致组蛋白去乙酰化和染色质收缩，沉默PyCAND1，进而干预泛素介导的蛋白降解途径，抑制配子体发育程序，维持丝状体形态；当环境信号触发世代转换时，PyKNOX表达降低，复合体解离，PyCAND1去抑制，泛素-蛋白酶体系统恢复正常，促进叶状体形成。
### 结论翻译
本研究为探究红藻条斑紫菜孢子体发育中转录因子KNOX的调控机制，鉴定出其互作蛋白和潜在靶基因。通过AP-MS及体内外验证，研究人员确认HDAC2作为互作蛋白与PyKNOX形成转录复合体；通过DAP-seq、酵母单杂交和EMSA实验，鉴定并验证CAND1是PyKNOX的潜在靶基因，CAND1是SCF复合体的重要组分。综上，研究人员提出HDAC2与PyKNOX互作形成的转录复合体介导对CAND1基因的转录抑制，该机制可能在条斑紫菜孢子体发育中发挥重要作用。
