《Practical Laboratory Medicine》：Effect of different storage conditions on the detection stability of vitamin K2 by liquid chromatography and tandem mass spectrometry
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摘要：目的：本研究首次比较了光照和温度对维生素K2（VK2）稳定性的影响，揭示了甲萘醌-4（MK-4）与甲萘醌-7（MK-7）的差异。方法：采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测血清样本中的MK-4和MK-7。血清样本分为四组：避光冷冻（-20°
摘要：目的：本研究首次比较了光照和温度对维生素K2（VK2）稳定性的影响，揭示了甲萘醌-4（MK-4）与甲萘醌-7（MK-7）的差异。方法：采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测血清样本中的MK-4和MK-7。血清样本分为四组：避光冷冻（-20°C）、避光冷藏（2-8°C）、避光室温（20-25°C）以及光照室温（20-25°C），分别在储存1天、2天和7天后计算回收率。结果：室温下光照暴露7天使MK-7的回收率低至22%，凸显了避光保护的关键性。MK-4的回收率受温度影响显著，而MK-7对光照更为敏感。最佳储存条件为：短期储存于4-8°C避光冷藏，长期储存于-20°C避光冷冻。结论：该研究为基于LC-MS/MS的VK2分析提供了循证储存方案和质量控制策略。
论文解读：不同储存条件对液相色谱-串联质谱法检测维生素K2稳定性的影响
一、研究背景与问题提出
维生素K2（VK2，即甲基萘醌类，MK-n）是一类脂溶性维生素，广泛存在于发酵食品和动物源性产品中，主要由细菌合成。其在人体内参与骨代谢、血管健康、能量代谢及炎症调节等多种重要生理过程，尤其是通过促进骨钙素等维生素K依赖性蛋白的羧化发挥作用。其中，甲萘醌-4（MK-4）主要来源于动物性食物，生物活性最高；甲萘醌-7（MK-7）则多见于发酵食品，生物利用度高且半衰期长达约72小时。
目前，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）已成为定量检测血浆中VK2（特别是MK-4和MK-7）的主流分析方法。然而，VK2在血液中基础浓度极低，且其结构中的醌环和不饱和侧链使其对光、热、氧等环境因素高度敏感，在样本处理与储存过程中极易降解，导致检测结果出现偏差。传统免疫学检测因交叉反应而不够可靠，因此系统评估不同储存条件对VK2稳定性的影响，建立标准化的样本前处理和储存方案，对于提高LC-MS/MS检测VK2的准确性和可靠性具有重要意义。
二、研究内容与结论
研究人员系统研究了不同储存条件对LC-MS/MS定量检测VK2（以MK-4和MK-7为代表）稳定性的影响，通过模拟实际检测流程中的常见储存场景，明确了温度、时间及光照是影响VK2稳定性的关键因素，并据此提出了针对性的样本储存建议。研究发现，储存条件是决定VK2稳定性的首要因素：光照是影响MK-7测量稳定性的关键变量，而储存温度则主导MK-4的保存效果。由此推荐分层储存方案：计划在7天内分析的样本应置于4-8°C避光冷藏；长期储存需在-20°C避光冷冻。这些发现为标准化LC-MS/MS分析VK2的储存流程和加强质量控制提供了直接的实验依据。
三、关键技术方法
- 1.
样本来源与分组：血清样本采集自北京积水潭医院首都医科大学2025年1月至3月期间的50例骨质疏松患者和50例健康对照者。所有样本被分为四组：避光冷冻（-20°C）、避光冷藏（2-8°C）、避光室温（20-25°C）及光照室温（20-25°C），分别在储存1、2、7天后检测MK-4和MK-7浓度并计算回收率。
- 2.
LC-MS/MS分析：采用安捷伦1290 Infinity II超高效液相色谱系统联用安捷伦6460三重四极杆质谱仪，配备大气压化学电离源（APCI），在正离子模式下以多反应监测模式（MRM）进行质谱检测。色谱分离使用Kinetex苯基-己基柱（C8, 2.5 μm, 2.1×100 mm），流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A相）和含0.1%甲酸的甲醇溶液（B相）。
- 3.
样本前处理：取250 μL血浆加入同位素内标工作液和1 mL蛋白沉淀剂（含1%甲酸的乙腈），涡旋离心后取上清液。随后采用液液萃取法，加入2 mL异辛烷（色谱级）重复提取两次，合并有机相后在35°C水浴中氮气吹干，残渣立即用90%乙醇复溶。
- 4.
稳定性评价标准：以回收率评估方法准确性，可接受范围一般为80%-120%。回收率计算公式为：回收率（%）= [（实际检出量 - 样本本底量）/ 标准品加入量] × 100%。
四、研究结果
1. 储存温度与MK-4的稳定性
避光冷冻条件下储存1天后，MK-4的回收率可达低浓度质控（QCL）：94.10%；中浓度质控（QCM）：110.94%；高浓度质控（QCH）：106.99%，显著高于避光冷藏和避光室温条件下的回收率。这表明温度对MK-4稳定性影响显著，建议样本短期储存于4°C冰箱，长期储存需冷冻于-20°C或-80°C。
2. 光照条件与MK-7的稳定性
避光室温条件下储存1天后，MK-7的回收率达QCL：88.55%；QCM：89.96%；QCH：78.84%，显著高于光照室温组的相应数值。这表明光照是影响MK-7稳定性的关键因素，样本必须避光储存，避免长时间暴露于高温或强光以防止氧化降解。
3. 储存时长与MK-4及MK-7的稳定性
在光照室温条件下储存7天后，MK-4的回收率降至QCL：19.38%；QCM：13.17%；QCH：18.32%；MK-7的回收率也降至QCL：28.51%；QCM：24.43%；QCH：22.01%，均远低于储存1天和2天的样本。这说明MK-4和MK-7的降解程度与时间成正比，储存时间越长降解越严重，因此血液样本采集后应尽快处理。
五、讨论与结论
讨论部分指出，VK2结构的醌环和不饱和侧链使其对光、热、氧高度敏感。高温可能引发水解或氧化反应，改变MK-4和MK-7的化学结构；低温则可通过降低分子运动速率和抑制氧化酶活性来减缓降解。光照，特别是紫外线和可见光，可诱导光化学反应，MK-7对此尤为敏感，可能产生干扰检测的光降解产物。因此，避光储存是确保LC-MS/MS检测一致性和准确性的必要条件。研究还建议，若24小时内完成检测，可在4°C避光短期储存；若储存期在7天内，应在-20°C避光冷冻并提前分装以避免反复冻融；超过7天则推荐-80°C深低温避光储存。检测过程中，样本从冰箱取出后在室温下不应超过60分钟，并建议使用棕色进样瓶以防止光降解。
研究结论：该研究表明储存条件是LC-MS/MS分析中维生素K2（K2）稳定性的首要决定因素。实验数据显示，光照是影响MK-7测量稳定性的关键变量，而储存温度则主导MK-4的保存效果。据此推荐分层储存方案：计划在7天内分析的样本应置于4-8°C避光冷藏；长期储存需在-20°C避光冷冻。这些发现为标准化基于LC-MS/MS的VK2分析中的储存程序并加强质量控制提供了直接的实验支持。
