基于流式细胞术的T细胞受体β链恒定区1/2偏斜评估作为人T细胞白血病病毒1型感染细胞克隆性的替代标志物

《British Journal of Haematology》：Flow cytometric assessment of T-cell receptor β-chain constant region 1/2 skewing as a surrogate marker for clonality in human T-cell leukaemia virus type-1–infected cells

　　

在人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）感染细胞群体中评估T细胞克隆性可能有助于成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）的风险评估和诊断。然而，直接评估HTLV-1整合位点克隆性需要昂贵且劳动密集的遗传学分析。研究人员通过将HTLV-1流式细胞术分析系统（HAS-Flow）方法（可高效识别HTLV-1感染细胞）与T细胞受体β链恒定区（TRBC1/2）染色相结合，开发了一种简单的流式细胞术替代检测方法。研究人员分析了53例HTLV-1感染者，包括无症状携带者（n = 25）、HTLV-1相关脊髓病（n = 4）和ATL患者（n = 24）。TRBC1/2偏斜通过优势TRBC比值进行量化。ATL患者的优势TRBC比值显著高于非ATL病例，并能有效区分ATL与非ATL病例（受试者工作特征曲线下面积[AUC]，0.913；95%置信区间，0.803–1.000；p < 0.0001）。该比值与已确立的疾病进展标志物（包括异常淋巴细胞负荷、前病毒载量和可溶性白细胞介素-2受体水平）以及通过两种独立的基于HTLV-1整合位点的方法（病毒整合位点和RAISING-CLOVA）评估的克隆性均相关。这些发现表明，在HTLV-1感染细胞中评估TRBC1/2偏斜（HAS-TRBC方法）是一种简单、经济有效的替代方法，可用于估计HTLV-1感染细胞群体内的T细胞克隆性，具有潜在的临床实用性。

论文解读

一、研究背景与意义

人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）是一种感染CD4⁺ T细胞的反转录病毒，全球约有数百万感染者。大多数感染者终身无症状，被视为无症状携带者。然而，约5%的携带者在漫长的潜伏期后最终发展为成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL），这是一种侵袭性极强的T细胞恶性肿瘤，预后极差。既往研究已明确，具有ATL家族史、高前病毒载量、HTLV-1感染细胞数量增加、感染细胞克隆性增殖以及基因突变积累的个体属于ATL高危人群。

在这些危险因素中，克隆性评估是肿瘤性转化最直接的指标。然而，现有的克隆性评估方法存在诸多局限：经典的Southern印迹法和反向聚合酶链反应难以进行定量评估；基于HTLV-1整合位点分析的方法劳动密集且费用高昂。因此，亟需一种更简便的方法来估计HTLV-1感染细胞群体内的克隆性。

在其他T细胞恶性肿瘤中，基于T细胞受体（TCR）的克隆性评估已被常规使用。近年来，一种基于流式细胞术的克隆性评估方法被开发出来，其原理是利用所有αβ T细胞均表达两种互斥的TCR β链恒定区（TRBC1和TRBC2），通过评估二者的偏斜程度来判断克隆性。然而，与其他T细胞恶性肿瘤不同，ATL的诊断要求特异性地识别HTLV-1感染细胞内的克隆性，因此仅基于TCR的克隆性评估并不充分。HAS-Flow方法能够基于CD4⁺ T细胞中细胞粘附分子1（CADM1）和CD7的表达准确识别HTLV-1感染细胞。研究人员假设将HAS-Flow与TRBC1/2双染色相结合，能够实现对HTLV-1感染细胞群体内T细胞克隆性的简便估计。本研究旨在评估该方法在HTLV-1感染者中的实用性。

二、主要技术方法

本研究为多中心研究，纳入了来自日本三家机构和英国一家机构的53例HTLV-1感染者，样本采集时间为2021年5月至2026年1月。队列包括25例HTLV-1无症状携带者、4例HTLV-1相关脊髓病（HAM）患者和24例ATL患者（其中9例冒烟型、8例慢性型、7例急性型）。研究采用的关键技术方法包括：基于CD3、CD4、CD8、CADM1和CD7表达进行流式细胞术分析，识别HTLV-1感染和未感染细胞，并结合TRBC1/2染色评估TRBC分布；通过实时PCR测量前病毒载量；采用基于捕获的靶向测序对分选的CD4⁺CADM1⁺细胞进行病毒整合位点（VIS）和基因组突变分析；以及使用RAISING-CLOVA方法评估克隆性。

三、研究结果

TRBC1/2偏斜作为HTLV-1感染者疾病进展的指标

研究人员根据CADM1和CD7表达将CD4⁺ T细胞分为P、D、N和CADM1⁺亚群，其中P亚群主要代表HTLV-1未感染细胞，CADM1⁺亚群富集HTLV-1感染细胞。每个亚群进一步分析TRBC1和TRBC2表达，分为TRBC1阳性、TRBC2阳性和TRBC1/2双阴性三个亚群。优势TRBC比值定义为TRBC1⁺与TRBC2⁺细胞比例中较高者与较低者之比。

与无症状携带者相比，ATL病例表现出增加的TRBC1/2偏斜，尤其在CADM1⁺和N亚群中。受试者工作特征（ROC）分析显示，CADM1⁺亚群的优势TRBC比值在所有评估亚群中具有最佳区分性能，区分ATL与非ATL病例的曲线下面积（AUC）为0.913，区分急性/慢性ATL与其他病例的AUC为0.910。基于ROC分析，确定了2.4和10.0两个截断值，分别用于最大化区分ATL与非ATL、急性/慢性ATL与其他病例的敏感性和特异性之和。CADM1⁺与N亚群的优势TRBC比值呈强相关，而D和P亚群的相关性较弱。

TRBC比值与ATL进展标志物的相关性

CADM1⁺亚群的优势TRBC比值与异常淋巴细胞比例和绝对数、前病毒载量及可溶性白细胞介素-2受体（sIL-2R）水平均呈显著正相关。以2.4为截断值时，高比值组的上述参数均显著高于低比值组。优势TRBC比值与CADM1⁺和N亚群比例呈显著正相关，与D亚群无显著相关，与P亚群呈显著负相关。

优势TRBC比值作为克隆扩增指标的验证

与基于HTLV-1整合位点基因组分析（VIS分析）得出的克隆大小估计值进行比较，多克隆VIS模式的病例优势TRBC比值接近1.0，而两例单克隆VIS模式的病例比值显著升高（分别为55.1和439.9）。一例急性ATL病例尽管TRBC偏斜显著，但VIS显示明显的寡克隆性。在确认克隆扩增的病例中，检测到ATL中常见体细胞突变且变异等位基因频率较高。优势TRBC比值与RAISING-CLOVA方法获得的克隆性值呈显著正相关。以既往报道的0.5克隆性截断值为界，高克隆性组的优势TRBC比值显著高于低克隆性组。

进展期ATL中的TRBC1/2双阴性

53例中3例（6%）在CADM1⁺亚群中表现为TRBC1/2双阴性，均为进展期ATL（2例慢性、1例急性），而无症状携带者、HAM和冒烟型ATL中未发现双阴性病例。在慢性/急性ATL的15例中，20%被归类为TRBC1/2双阴性。值得注意的是，3例表面双阴性病例中有2例经胞内TRBC1/2染色显示明显的TRBC限制性，而另1例仍为TRBC1/2双阴性。所有TRBC1/2双阴性病例在CADM1⁺亚群中CD3表达较P亚群降低，且CD3表达显著低于其他慢性/急性ATL病例。

TRBC评估的进一步潜在应用

急性ATL患者治疗后外周血异常淋巴细胞降至≤1%的病例，其优势TRBC比值显著低于持续外周血受累的病例，提示TRBC偏斜随治疗反应而降低。在组织标本中，有ATL浸润的标本表现出显著的TRBC1/2偏斜，而无ATL浸润的标本偏斜极小，提示TRBC评估可能适用于组织标本。

四、讨论与结论

本研究验证了HAS-TRBC方法在HTLV-1感染者中的实用性。CADM1⁺亚群中TRBC1/2偏斜与HTLV-1整合位点克隆性的相关性支持其作为克隆扩增的替代指标。由于TRBC1/2提供二元读数，在复杂克隆状态下对克隆大小的准确估计可能受限；反之，遗传克隆性分析在某些情况下也可能难以解释。HAS-TRBC可为遗传克隆性分析提供互补信息。与TRBC分析在其他T细胞恶性肿瘤中可能遇到的限制相比，HAS-TRBC将分析限定于富集HTLV-1感染细胞的CADM1⁺亚群，减少了非肿瘤性因素（如感染）导致的TRBC偏斜干扰。与需要24种抗TCR-Vβ抗体的方法相比，HAS-TRBC仅需在标准HAS-Flow组合中增加TRBC1和TRBC2抗体，更为简便和经济。

截断值的选择是解读TRBC1/2偏斜的重要考量。2.4的截断值来源于ROC分析，用于区分ATL与非ATL，提供81%的敏感性和100%的特异性，应被视为疾病区分阈值而非克隆性的确定性阈值。5.7的截断值（对应TRBC1阳性<15%或>85%）保持了100%的特异性但敏感性降至62%。10.0的截断值用于区分急性/慢性ATL与其他病例，提供83%的敏感性和97%的特异性。最佳阈值可能取决于临床目的和所评估的T细胞群体。

表面TRBC评估在3例（20%）慢性/急性ATL中因CD3表达降低而困难。胞内TRBC1/2染色可克服部分表面TRBC评估的局限。对于胞内染色后仍为TRBC1/2双阴性的病例，可能需要分子或遗传学方法进行克隆性评估。

本研究的主要局限包括样本量相对较小、TRBC1/2偏斜的标准化截断值尚未建立、未评估CD8⁺ ATL等非典型免疫表型亚型，以及机构间差异可能影响TRBC测量的可重复性。

综上所述，HAS-TRBC方法是一种简单、基于流式细胞术的方法，可用于估计HTLV-1感染细胞内的T细胞克隆性。该方法适用广泛、操作简便，且比遗传学克隆性评估方法更具成本效益。尽管需要在更大队列中进一步验证，HAS-TRBC是评估HTLV-1感染细胞内T细胞克隆性的实用且临床可应用的工具。