《Peptides》：Synthetic host defence peptides modulate phagocytic activity and release of inflammatory mediators by BV-2 microglial cells
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合成宿主防御肽（host defence peptides）调节BV-2小胶质细胞（microglial cells）的吞噬活性及炎症介质释放。IDR-1002、IDR-1018和D-3006降低BV-2小鼠小胶质细胞（murine microglia）的一氧
合成宿主防御肽（host defence peptides）调节BV-2小胶质细胞（microglial cells）的吞噬活性及炎症介质释放。IDR-1002、IDR-1018和D-3006降低BV-2小鼠小胶质细胞（murine microglia）的一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子（TNF）释放。三种肽均降低分化的HL-60细胞（differentiated HL-60 cells）中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）依赖的活性氧（ROS）释放。肽改变脂多糖（LPS）刺激的BV-2小胶质细胞的吞噬活性。D-3006是一种合成的D型对映体肽（D-enantiomeric peptide），在小胶质细胞中具有免疫调节作用。合成宿主防御肽在体外调节小胶质细胞神经免疫功能（neuroimmune functions）。
研究背景：内源性宿主防御肽（host defence peptides），亦称抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），最初因杀伤病原体而受关注，现被认为具有超越抗菌作用的多种宿主防御功能。心理应激可降低小鼠皮肤cathelin相关抗菌肽（CRAMP）表达，增加皮肤感染易感性。宿主防御肽参与健康衰老及病理过程，包括神经炎症和神经退行，有限研究提示其具有神经保护潜力。小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统（central nervous system，CNS）常驻固有免疫细胞，监视实质并协调损伤、感染和稳态改变反应。合成的先天防御调节肽（innate defence regulator，IDR）IDR-1002和IDR-1018为L型对映体，具增强免疫调节特性。IDR-1002可降低巨噬细胞、中性粒细胞和小胶质细胞促炎细胞因子产生并上调保护功能；IDR-1018具有广泛免疫调节活性，如调节Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号、减少炎症介质和促进保护性免疫。D-3006为D型对映体合成宿主防御肽，较不易被宿主蛋白酶降解，体内半衰期延长，但其生物活性研究有限，仅显示可减少严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）复制。鉴于小胶质细胞固有免疫反应可增加脑损伤易感性并驱动神经退行，合成宿主防御肽可能通过有利调节小胶质细胞神经免疫功能提供治疗益处。研究人员考察IDR-1002、IDR-1018和D-3006在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、干扰素（interferon，IFN）-γ及二者联合刺激下，调节小胶质细胞炎症介质产生、细胞毒和吞噬活性的能力；首次在神经免疫背景表征D-3006，并并排比较三者。总体显示环境依赖抗炎特性，减少炎症介质和细胞毒活性，降低免疫刺激诱导的吞噬活性。其意义在于推进理解设计肽如何调节与神经疾病相关的神经免疫反应。
关键技术方法：样本来源方面，BV-2小鼠小胶质细胞由Dr. G. Garden（University of Washington, Seattle, WA, USA）捐赠；NSC-34小鼠神经元样细胞来自Dr. A. Milnerwood（Brain Research Centre, UBC, Vancouver, BC, Canada）；HL-60人髓单核细胞系购自American Type Culture Collection（ATCC，Manassas, VA, USA）。方法上，以BV-2暴露于LPS、IFN-γ或联合，Griess法测亚硝酸盐反映一氧化氮（NO），酶联免疫吸附试验（ELISA）测肿瘤坏死因子（TNF），3-(4,5-二甲基-3-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴盐（MTT）法测活力；将BV-2无细胞上清转移至NSC-34测神经毒性；荧光乳胶珠测吞噬活性；二甲基亚砜（DMSO）分化HL-60经LPS priming、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）刺激，luminol增强化学发光测活性氧（reactive oxygen species，ROS）；统计用随机区组ANOVA/Dunnett及Tukey。
研究结果：
3.1 宿主防御肽降低免疫刺激BV-2小胶质细胞的NO释放。研究人员用LPS刺激BV-2并用Griess法测亚硝酸盐。50 μg/mL IDR-1002、25和50 μg/mL IDR-1018、25和50 μg/mL D-3006使亚硝酸盐积累降低约17–42%；最高浓度三种肽使LPS处理BV-2活力增加18–22%，不影响未刺激BV-2活力。LPS+IFN-γ时，IDR-1002呈降低趋势但不显著；IDR-1018仅最高浓度降低29%；D-3006浓度依赖降低约10–33%。MTT显示D-3006和IDR-1018不降低活力，IDR-1002最高两浓度增加存活约8–49%。IFN-γ单独不影响NO或活力。
3.2 宿主防御肽对免疫刺激BV-2小胶质细胞TNF分泌有不同影响。LPS和LPS+IFN-γ诱导TNF，IFN-γ单独无作用。IDR-1002对LPS处理细胞在25和50 μg/mL降低TNF约16–20%，对LPS+IFN-γ无此作用。IDR-1018呈浓度依赖降低趋势但不显著。D-3006对LPS和LPS+IFN-γ均在25和50 μg/mL显著抑制TNF约39–44%。
3.3 宿主防御肽显著降低ROS产生。DMSO分化HL-60经LPS priming和fMLP刺激，luminol化学发光测ROS。三种肽浓度依赖降低ROS，最高浓度降低约60–93%，IDR-1018和D-3006尤其强；不影响HL-60活力。
3.4 IDR-1018持续降低BV-2小胶质细胞毒性分子释放，而IDR-1002和D-3006效应依赖刺激物。将刺激后BV-2上清转移至NSC-34，MTT测活力。LPS、IFN-γ、联合刺激的BV-2上清使NSC-34活力降低约30%。最高浓度IDR-1002、IDR-1018、D-3006显著降低LPS或LPS+IFN-γ刺激BV-2的神经毒性分泌物，表现为NSC-34活力增加。IFN-γ单独时，仅IDR-1018最高浓度显示保护；D-3006无效，IDR-1002仅有非显著趋势。对照中IDR-1002或IDR-1018直接孵育NSC-34 72 h不改变活力，提示非直接肽carry-over；D-3006未做该对照，不能排除carry-over直接贡献。
3.5 宿主防御肽调节BV-2小胶质细胞吞噬活性。荧光乳胶珠摄取实验显示LPS刺激使BV-2摄珠增加250–400%。IDR-1002、IDR-1018、D-3006预处理分别使LPS诱导的吞噬增加降低25%、45%、60%，但均未降至未刺激基线。未刺激条件下，IDR-1018和D-3006分别增加吞噬50%和150%，IDR-1002不显著改变基础吞噬。
讨论与结论翻译：讨论部分指出，宿主防御肽及合成IDR衍生物是维持CNS稳态、防止组织损伤的重要免疫调节剂；外周组织功能明确，而脑内工程化衍生物调节疾病过程了解较少。内源性宿主防御肽如cathelicidins、defensins、hepcidin可由小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元在稳态及神经退行病中表达，但脑内免疫调节作用被忽视。CRAMP抑制LPS诱导BV-2、原代小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的NO、TNF、C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）产生，并减轻小鼠LPS神经炎症；人β-防御素3通过抑制核因子（NF）-κB通路抑制BV-2的LPS诱导白细胞介素（IL）-1β。这些为合成IDR提供依据。本研究显示IDR肽广泛但环境依赖地调节小胶质细胞活化及细胞毒性分子释放，且不损害活力。IDR-1018和D-3006抗炎谱较一致：IDR-1018降低LPS刺激BV-2的NO，降低分化HL-60的ROS，并对小胶质介导神经元毒性有明显保护；D-3006类似并额外降低TNF，但仅在特定刺激条件保护神经元。早期报道IDR-1018降低LPS诱导TNF，与本数据不一致，讨论归因于新生小胶质细胞与BV-2成熟表型的差异。IDR-1002降低TNF但与既往比作用较弱。与中性粒细胞中IDR单独诱导炎症介质不同，本研究未观察到这些肽触发小胶质细胞促炎分子释放。D-3006数据新，此前仅一篇抗病毒研究报道其比IDR-1018更有效；本研究显示D-3006与IDR-1002影响炎症介质方式相似但抗炎活性更明显。IDR-1018既往体内研究显示其穿过血脑屏障并减轻LPS加缺血损伤后的脑损伤，降低皮质、海马、丘脑、纹状体灰白质疾病评分；IDR-1002无临床显著脑保护，与其较弱抗炎及脑内蓄积有限一致。减少TNF、NO、ROS可能支持神经保护；IDR-1002和IDR-1018不直接改变NSC-34活力支持小胶质介导机制，D-3006直接作用不能完全排除。讨论也强调神经保护具刺激依赖性，未来应测试多种小胶质细胞反应诱导剂。局限包括：肽在LPS前加入，阳离子肽可能直接结合并中和LPS，不能完全排除；需刺激后添加和洗涤、LPS结合实验。主要发现来自永生化BV-2和分化HL-60，后者模拟烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶依赖呼吸爆发而非真正小胶质细胞，需原代小鼠或人小胶质模型验证。研究仅功能层面，未进行蛋白或转录验证，如未检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB p65 Western blot，或Tnf和Nos2逆转录定量PCR（RT-qPCR），因此通路归因仍是推断。吞噬读数为校正总细胞荧光，不能完全区分内化和表面结合，最好解释为珠关联变化，需淬灭、共聚焦z-stack或流式确认。所用浓度达约30–32 μM，高于脑内可能达到的暴露，治疗相关性依赖稳定性、组织分布、毒性和血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）递送；D型D-3006蛋白酶抗性可能延长半衰期，但其生物分布和CNS穿透未建立。另一研究显示IDR-1018等增加外周血单核细胞对凋亡细胞的吞噬；本研究证实IDR-1018增加免疫细胞吞噬，并显示D-3006类似，同时所有IDR降低LPS诱导的BV-2吞噬。讨论提出静息小胶质中肽可能通过Gi偶联受体、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、MAPK和NF-κB通路适度提高基础吞噬；LPS下吞噬主要由TLR4驱动，IDR-1002等抑制TLR激动剂诱导炎症反应并部分抑制NF-κB亚基核转位，同时激活p38/细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）-丝裂原和应激激活激酶1/2（mitogen- and stress-activated kinase 1/2，MSK1/2）-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）信号，因此LPS刺激BV-2摄取减少与TLR4驱动成分减弱一致；该解释基于非小胶质机制且未在本研究测试。小胶质吞噬可保护或损害，取决于货物和疾病背景；本研究测惰性乳胶珠，因此解释为IDR改变吞噬活性而非恢复有益稳态。失调吞噬与病理突触修剪和神经元丢失有关，需疾病相关货物动物模型评估。虽然动物模型中合成IDR给药未见死亡或不良效应，但这些肽可能诱导致病性吞噬凋亡（phagoptosis），应研究对CNS健康其他参数如动物行为的影响。
研究结论翻译：通过比较IDR-1002、IDR-1018和D型对映体肽D-3006在多种小胶质细胞功能和免疫刺激条件下的效应，并首次在神经免疫背景下表征D-3006，本研究将既往关于IDR肽抗炎活性的报道扩展至小胶质细胞功能调节。总体而言，数据表明合成宿主防御肽可调节多种促炎性小胶质细胞输出，并可在特定体外炎症条件下改善暴露于小胶质细胞上清的神经元细胞活力。IDR-1002、IDR-1018和D-3006的环境依赖性效应强调将肽活性与神经炎症状态匹配的重要性。这些体外发现支持进一步研究合成宿主防御肽作为神经炎症候选调节剂，并为未来研究提供依据，同时承认小胶质细胞中的通路水平机制验证以及治疗获益和神经保护的体内确认仍有待建立。
