整合应激信号通路通过缺氧/HIFs、p53/p63与自噬相关蛋白质量控制促进Metaphyseal Chondrodysplasia Type Schmid（MCDS）肥厚软骨细胞存活的适应性重编程

《Bone Research》：Integrated stress signaling pathways promote adaptive reprogramming for chondrocyte survival in Metaphyseal Chondrodysplasia Type Schmid

由Col10a1基因编码的Collagen X（X型胶原）在软骨中由肥厚软骨细胞（hypertrophic chondrocytes，HCs）特异性表达。人类Col10a1基因突变会增加HCs中的内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激，导致Metaphyseal Chondrodysplasia Type Schmid（MCDS，干骺端软骨发育不良Schmid型）。然而，HCs如何响应ER应激以影响骨发育和生长的机制尚未完全明了。在本研究中，研究人员构建了一个在内源性Col10a1基因中携带13 bp缺失（13del）的新小鼠模型。这些13del-MCDS小鼠表现出人类MCDS所有已知临床特征，以及生长板软骨内的分子和细胞变化。研究人员首次发现，触发ER应激在体内导致缺氧和缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）通路激活，促进13del-MCDS小鼠HCs的细胞存活。为检验激活的缺氧和HIFs通路是由ER应激还是外源因素触发，研究人员构建了WT/GFP-MCDS嵌合小鼠。研究结果显示，缺氧及缺氧通路的激活是对ER应激的内在响应，可能部分通过小鼠HCs中激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的激活而发生。同时，观察到p53通路变化和自噬相关蛋白质量控制响应，与软骨细胞分化和存活改变存在空间关联。这些发现揭示了肥厚软骨细胞对慢性ER应激的适应性响应过程中多个应激响应通路的协调参与。

研究背景与问题：Metaphyseal Chondrodysplasia Type Schmid（MCDS，干骺端软骨发育不良Schmid型）是一种罕见常染色体显性骨骼疾病，表现为矮身材、短肢、髋内翻、膝内翻和摇摆步态。MCDS与COL10A1突变相关，COL10A1编码Collagen X（X型胶原），后者由生长板中的肥厚软骨细胞（hypertrophic chondrocytes，HCs）表达。多数突变位于NC1结构域，影响三聚体形成和分泌，导致未折叠蛋白在内质网（endoplasmic reticulum，ER）中滞留并激活内质网应激信号（ER stress signaling，ERSS）和未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。既往转基因或基因靶向小鼠模型仅部分重现人类MCDS特征，且HCs如何通过慢性ER应激影响骨发育和生长的机制仍未完全明确。研究人员因此构建更真实的内源Col10a1突变模型，并解析HCs的适应性存活机制。该研究发表于《Bone Research》。

研究概况与意义：研究人员通过同源重组在内源性Col10a1基因中引入与人类MCDS相同的13 bp缺失（c.1857_1869del13），生成13del-MCDS小鼠。该模型表现出人类MCDS所有已报道临床、影像、组织学和分子细胞特征。研究首次在体内发现ER应激可触发缺氧和HIFs通路，并证明这是HCs对ER应激的内在响应，可能部分经由ATF4。与此同时，p53/p63网络、ASPP/iASPP调节和自噬相关蛋白质量控制与HCs存活、分化改变及细胞周期再进入空间相关。该研究提出多种应激响应通路协同构成HCs适应性存活网络，为MCDS治疗提供新思路。

关键技术方法概述：研究采用基因靶向同源重组在129svev胚胎干细胞中引入Col10a1 13del，经C57bl/6囊胚注射和Flp删除筛选标记，建立M/+×M/+繁育体系；以M/M与GFP表达小鼠聚合生成WT/GFP-MCDS嵌合体。主要技术包括X线影像、骨架染色、组织学染色、原位杂交、免疫组织化学和免疫荧光、BrdU掺入、TUNEL、EF5缺氧检测、氯喹自噬通量分析、坐骨神经切断卸载、Hif1α条件性失活尝试、C10-Atf4转基因和Col10a1-null小鼠比较。样本来源均为小鼠模型，无人类队列。

研究结果：
1. 13del-MCDS小鼠表现出人类MCDS所有已报道特征。通过影像学、骨架制备和组织学分析发现，M/+和M/M小鼠出生时较小，P10后出现剂量依赖性侏儒、椎体和长骨缩短、胫骨弯曲、干骺端展开、髋内翻、肋软骨异常及掌骨指骨缩短；生长板肥厚区扩张，M/M更明显；原位杂交和免疫组化显示13del等位基因由HCs特异表达，突变蛋白在细胞内积累；坐骨神经切断卸载可改善干骺端异常。
2. ER应激激活与肥厚软骨细胞分化改变和细胞周期再进入相关。ER应激标志CHOP、GADD34、ATF3、Bip和Xbp1s上调；M/M HCs在P10表达Col2a1及前肥厚标志Ppr、Ihh，多数肥厚区细胞表达p57^Kip2提示退出细胞周期；4周时，上肥厚区cyclin D1降低，中下肥厚区cyclin D1和BrdU重新出现，形成两个Col10a1阳性肥厚区，Mmp13在软骨-骨交界表达减少。
3. ER应激下肥厚软骨细胞中缺氧通路的参与。EF5检测显示，WT小鼠E15.5缺氧信号位于增殖区和上肥厚区，而M/M肥厚区亦强信号；E18.5和P10时M/M中EF5与胞内ColX-13del空间相关；CD31分布无明显差异；WT中HIF1α和HIF2α主要位于储备和增殖区，M/M中扩展至整个扩张肥厚区。Hif1α条件性失活未完全成功，无法建立直接功能关系。
4. 13del-MCDS小鼠肥厚软骨细胞中缺氧响应的激活是对ER应激的内在响应。Col10a1-null小鼠无EF5信号改变；Talus骨中M/M显示强EF5信号而Col10a1-null无；WT/GFP-MCDS嵌合小鼠中EF5信号仅见于M/M来源HCs，邻近WT HCs无信号。ATF4在M/M HCs中升高，C10-Atf4转基因小鼠中HIF1α和HIF2α被激活。结论为缺氧/HIFs激活是HCs对ER应激的内在响应，部分通过ATF4。
5. p53/p63网络巩固存活并促进向细胞周期再进入进展。WT中p53主要见于增殖和前肥厚细胞，M/M扩张肥厚区出现高p53细胞；低p53细胞形态较大较圆，高p53细胞较小较扁且p53核定位；TAp63上调，ΔNp63下调；ASPP2下调而iASPP上调。核p53/TAp63未导致明显凋亡，提示ASPP/iASPP平衡提供保护，p53/TAp63可能主要参与细胞周期调控。
6. 经自噬清除未折叠ColX-13del与肥厚软骨细胞存活和细胞周期再进入相关。4周M/M中ColX-13del和p53在上、下肥厚区高，中肥厚区低，提示中区蛋白被清除；EDEM在中下肥厚区上调，提示内质网相关降解（ER-associated degradation，ERAD）参与；Map1lc3/LC3 puncta在高自噬区与细胞周期再进入区相关；氯喹处理后上、下肥厚区LC3 puncta增加，提示自噬通量持续。结论为自噬相关蛋白质量控制参与突变HCs在ER应激下的存活和再进入。

讨论总结与研究结论翻译：既往五种MCDS遗传修饰小鼠模型均仅表现部分人类特征，而13del-MCDS模型更完整，适合作临床前模型。UPR激活是MCDS病理机制，但HCs通过适应性反应改变终末分化和骨化，导致生长受损。CHOP虽常促凋亡，但在该情境中呈促存活作用；ATF4/CHOP可诱导Fgf21，ER-线粒体通讯、钙转运、ATP供应和能量平衡参与存活。ER应激与缺氧紧密关联，本研究提示HCs中ER应激可驱动缺氧并稳定HIF信号。ATF4可维持氧化磷酸化并促进HIF1α积累，形成细胞自主缺氧微环境。p53可被ER应激和缺氧激活，核p53可诱导自噬；ASPP2下调和iASPP上调可能抑制凋亡。重编程HCs出现二次肥厚，自噬清除未折叠胶原并降低p53，可能促进细胞周期再进入。治疗上，卡马西平（carbamazepine，CBZ）和整合应激反应抑制剂（integrated stress response inhibitor，ISRIB）具潜力，联合管理缺氧和能量需求策略可能恢复MCDS骨生长。

研究结论部分翻译：综上所述，13del-MCDS小鼠中的HC存活似乎涉及能量需求管理和现有HIFα蛋白稳定。尽管ERAD在整个肥厚区被激活，自噬相关机制可能有助于更完全清除未折叠蛋白，可能通过ATF4在缺氧条件下诱导自噬。在此背景下，降低的p53水平可能促进重编程软骨细胞的细胞周期再进入，并可能通过ATF4介导的反式激活与Sox9表达相关。最后，研究结果支持当前针对蛋白清除使用卡马西平和靶向PERK-ATF4传感器的ISRIB的治疗策略；将这些方法与管理缺氧相关和能量需求响应的策略结合，可能有助于重置内软骨成骨程序的脱轨并恢复MCDS患者的骨生长。