两种近缘 Orchis 物种根提取物植物合成银纳米颗粒（AgNPs）：理化表征及抗菌、抗氧化与脲酶抑制活性的比较研究

《Next Nanotechnology》：Phytogenic silver nanoparticles from two Orchis species: Characterization and biological activities

　　

利用药用植物绿色合成银纳米颗粒（silver nanoparticles, AgNPs）为制备具有生物活性的纳米材料提供了一种环境友好途径，但针对亲缘关系较近的 Orchis 属物种的比较研究仍有限。本研究利用 Orchis latifolia 和 Orchis mascula 的水溶性根提取物进行 AgNPs 植物合成（phytofabrication），随后进行理化表征，并评价其抗菌、抗氧化和脲酶抑制活性。紫外–可见光谱（UV–visible spectroscopy）、能谱分析（energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、动态光散射（dynamic light scattering, DLS）、傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR）、X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）、热重分析（thermogravimetric analysis, TGA）和差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）分析支持 AgNPs 成功形成。纳米颗粒主要呈圆形/球形形态，O. latifolia 和 O. mascula 来源 AgNPs 的水合粒径分别为 26.92 和 56.87 nm，多分散指数分别为 0.565 和 0.290。XRD 分析证实其晶态面心立方（face-centered cubic, fcc）结构，并具有对应于（111）、（200）、（220）和（311）晶面的特征性 Ag 衍射。两种 AgNPs 对所测试微生物均表现出广谱抗菌活性。O. latifolia 来源 AgNPs 表现出更高的 DPPH 自由基清除活性，在 1000 μg/mL 时达到 62.72 ± 2.68%，而 O. mascula 来源 AgNPs 表现出更强的脲酶抑制活性（84.14 ± 1.13%）并且总体上抗菌作用更强。流式细胞术分析进一步表明，AgNPs 暴露后引起显著的膜损伤，并在若干微生物物种中增加了细胞内 ROS（reactive oxygen species，活性氧）水平。总体而言，研究结果表明，亲缘关系较近的 Orchis 物种可制备具有不同理化与生物学性质的 AgNPs，体现了植物物种特异性植物化学物质（phytochemicals）对植物合成纳米材料功能的影响。

绿色合成纳米颗粒（nanoparticles, NPs）通常指利用植物提取物、微生物或生物分子在环境友好条件下将金属离子还原为纳米材料，以替代常涉及有毒底物或高能量输入的传统化学和物理纳米制备技术。植物介导合成尤其受关注，因为植物提取物中的植物化学物质（phytochemicals）可同时作为还原剂、稳定剂和封端剂，从而在不使用危险化学品的条件下形成稳定 NPs，并提高生物相容性、降低环境影响。对于银纳米颗粒（silver nanoparticles, AgNPs）等金属 NPs，绿色合成可获得尺寸和形貌可控的材料，而尺寸和形貌是决定生物活性与功能性能的关键因素。已有研究报道绿色合成 AgNPs 具有抗菌、抗癌、抗炎、光保护、抗增殖和抗糖尿病等活性，并在农业中显示抗真菌、抗菌、病害管理和植物生长促进作用。O. latifolia 和 Orchis mascula 为兰科（Orchidaceae）地生兰，已有实验和综述报道其多种生物学和生物医学特性；O. mascula 叶水提物还被报道可还原 Cu²⁺ 以绿色制备铜 NPs，提示 Orchis 物种具备参与 NPs 生物合成的能力。然而，利用 O. latifolia 和 O. mascula 绿色合成 AgNPs 的信息有限，尤其缺乏对二者理化特征和生物活性的比较；同一属内亲缘关系较近的物种是否因植物化学成分差异而差异性影响纳米颗粒形成、尺寸、形貌、表面化学和生物活性，仍探索不足。因此，研究人员旨在利用 O. latifolia 和 O. mascula 根提取物以环境友好方式生物合成 AgNPs，全面表征所得 NPs，并比较评价其抗菌、抗氧化和酶抑制活性，以揭示物种依赖性差异及其相关生物学性质。

研究人员成功制备了 AgNPs，并通过多种表征确认形成植物化学物质封端且具有晶态的 AgNPs。两种 Orchis 物种来源 AgNPs 在水合粒径、表面特征、热行为和生物活性方面存在差异，提示植物物种可影响纳米颗粒形成和稳定。O. mascula 介导的 AgNPs 总体上表现出更强的抗菌和脲酶抑制效果，而 O. latifolia 介导的 AgNPs 表现出更高的 DPPH 自由基清除活性。流式细胞术进一步显示 AgNPs 可诱导微生物细胞活力改变，并在部分微生物中增加细胞内 ROS（reactive oxygen species，活性氧）生成，支持氧化应激和细胞损伤参与抗菌活性。该研究说明，近缘 Orchis 物种可生成具有不同理化特征和生物学性能的 AgNPs，强调绿色纳米技术中植物来源选择的重要性，并为 O. latifolia 和 O. mascula 作为可再生生物活性 AgNPs 来源提供了见解。

关键技术方法概括：根样来自伊朗德黑兰当地市场，并经 Shahid Beheshti University of Medical Sciences 药学院生药学系鉴定；所用微生物菌株来自该大学中央研究实验室微生物学系。研究人员制备两种植物根水提物，与 AgNO₃ 溶液混合，调节 pH 4–12，于 28°C、150 rpm 孵育 24 h，经离心和洗涤收集 AgNPs。表征采用 UV–可见光谱、EDX、TEM、DLS、FT-IR、XRD、TGA 和 DSC。抗菌评价采用井扩散法、肉汤微量稀释法测定 MIC、MBC 和 MFC，PI 流式细胞术测定细胞活力，DCFH-DA 流式细胞术测定 ROS。抗氧化采用 DPPH 法，脲酶抑制采用靛酚反应。数据使用 GraphPad Prism 7.0 进行单因素 ANOVA 和 Tukey 多重比较检验，结果为三次独立实验的 mean ± SD，显著性设为 P<0.05。

研究结果如下。

3.1 植物合成与 AgNPs 表征：反应混合物加入根提取物后由浅黄色变为深棕色，且棕色强度随 pH 升高而增加，提示碱性条件增强纳米颗粒形成；UV–可见光谱显示两种 AgNPs 最高表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）吸收均在 pH 10。O. latifolia 来源 AgNPs 的 λmax 为 407 nm，O. mascula 来源 AgNPs 的 λmax 为 412 nm；单独的 AgNO₃ 溶液或植物提取物在 300–600 nm 范围内无特征吸收峰。EDX 在约 3 keV 处显示强银信号，金信号来自 EDX 制样镀金，碳和氧弱信号可能来自吸附于表面的植物化学残留。TEM 显示二者主要为圆形/球形形态且形貌较均匀。DLS 显示，O. latifolia 来源 AgNPs 水合粒径为 26.92 nm，PdI 为 0.565，zeta 电位为 ?21.8 mV；O. mascula 来源 AgNPs 水合粒径为 56.87 nm，PdI 为 0.290，zeta 电位为 ?27.2 mV。TGA 显示 O. latifolia 和 O. mascula 来源 AgNPs 总失重分别为 43.57% 和 45.35%，DSC 热转变模式不同，提示表面植物化学涂层的组成和分子组织存在差异。FT-IR 显示 O–H、C=C、N–O、C–H、C–O 等振动，且植物提取物与其对应 AgNPs 的光谱特征相似，说明这些植物化学物质参与 Ag⁺ 还原和 NPs 稳定；但 FT-IR 不能鉴定具体植物化学物质。XRD 峰分别位于约 38°、44°、64° 和 77°，对应（111）、（200）、（220）和（311）晶面，证实二者为金属银的面心立方（face-centered cubic, fcc）晶态结构，并符合 JCPDS No. 00–004–0783。

3.2 植物合成 AgNPs 的抗菌活性：两种根提取物本身无抑制效果，而两种 AgNPs 均表现出广谱抗菌和抗真菌活性。O. mascula 来源 AgNPs 对多数测试微生物产生较大抑菌圈。AgNPs 的抗菌机制包括破坏细胞膜、增加通透性、通过 ROS 生成诱导氧化应激，以及破坏蛋白质、DNA 和必需细胞过程，最终导致微生物死亡。

3.2.1 井扩散法：井扩散实验显示，O. latifolia 和 O. mascula 根提取物无抑制圈，而 AgNPs 对测试细菌和真菌均有活性。O. mascula 来源 AgNPs 对多数革兰氏阳性和革兰氏阴性菌产生较大抑菌圈，总体上抗菌作用更强。

3.2.2 肉汤微量稀释法：肉汤微量稀释法显示，O. mascula 来源 AgNPs 的 MIC 和 MBC 通常低于 O. latifolia 来源 AgNPs，提示其抗菌效力更高；MBC 通常等于 MIC 或高一个稀释度，提示浓度依赖性杀菌作用。与标准抗生素相比，这些植物合成 AgNPs 的效力较低，但支持其作为替代抗菌剂的潜力。

3.2.3 流式细胞术定量细胞活力：以 PI 染色的流式细胞术在 MIC 水平处理 6 h 后定量细胞活力。C. albicans 未处理细胞死亡率仅 0.945%，O. latifolia–AgNPs 和 O. mascula–AgNPs 分别使 PI 阳性群体升至 33.4% 和 39.1%，接近 amphotericin B 的 35.4%。S. epidermidis 中，细胞死亡由对照的 0.861% 升至 58.2% 和 60.9%，与 gentamicin 的 54.1% 相近。S. typhimurium 中，细胞死亡由 1.33% 升至 27.0% 和 54.2%，gentamicin 为 69.2%。S. marcescens 中，未处理为 1.30%，AgNPs 处理后为 35.2% 和 33.0%，gentamicin 为 34.6%。S. aureus 中，细胞死亡由 0.761% 显著升至 89.5% 和 86.9%，与 gentamicin 的 85.8% 接近。结果表明 AgNPs 在 MIC 水平诱导显著的、菌株依赖性的细胞活力丧失，主要通过膜损伤实现。

3.2.4 流式细胞术定量 ROS：以流式细胞术在 MIC 水平处理 6 h 后定量细胞内 ROS。C. albicans 未处理基线 ROS 为 1.51%，O. latifolia–AgNPs 和 O. mascula–AgNPs 处理后升至 18.8% 和 12.0%，amphotericin B 为 61.3%。S. epidermidis 中，未处理为 0.056%，AgNPs 处理后仅升至 0.147% 和 0.171%，gentamicin 为 0.792%。S. typhimurium 中，未处理为 1.44%，AgNPs 处理后为 3.52% 和 4.48%，gentamicin 为 7.48%。S. marcescens 中，未处理为 0.446%，O. latifolia–AgNPs 和 O. mascula–AgNPs 处理分别为 0.148% 和 0.121%，gentamicin 为 1.13%。S. aureus 中，未处理为 0.965%，AgNPs 处理后升至 16.2% 和 6.93%，gentamicin 为 32.5%。结果表明 ROS 升高并非在所有微生物中普遍出现，氧化应激是部分微生物的抗菌机制之一，AgNPs 抗菌作用具有复杂、多层面特征。

3.3 植物合成 AgNPs 的抗氧化活性：DPPH 实验显示，O. latifolia 来源 AgNPs 在 1000 μg·mL^?1 时抗氧化活性为 62.72 ± 2.68%，显著高于 500 μg·mL^?1 的 42.06 ± 1.87% 和 250 μg·mL^?1 的 32.53 ± 1.63%；O. latifolia 根提取物 0.1% 的活性为 14.18 ± 1.49%。O. mascula 来源 AgNPs 在 1000 μg·mL^?1 时为 54.77 ± 1.21%，显著高于 500 μg·mL^?1 的 36.92 ± 1.68% 和 250 μg·mL^?1 的 26.98 ± 1.61%；O. mascula 根提取物 0.1% 的活性为 19.62 ± 2.20%。阳性对照抗坏血酸 20 μg·mL^?1 的 DPPH 自由基清除活性最高，为 93.52 ± 2.15%。结果表明抗氧化活性呈浓度依赖性，O. latifolia 来源 AgNPs 的 DPPH 清除活性相对更高。

3.4 植物合成 AgNPs 的脲酶抑制活性：脲酶抑制实验显示，O. latifolia 来源 AgNPs 在 1000 μg·mL^?1 时抑制率为 69.53 ± 2.52%，显著高于 500 μg·mL^?1 的 57.18 ± 2.25% 和 250 μg·mL^?1 的 44.14 ± 2.26%；O. latifolia 根提取物 0.1% 的抑制率为 4.95 ± 1.26%。O. mascula 来源 AgNPs 在 1000 μg·mL^?1 时为 84.14 ± 1.13%，显著高于 500 μg·mL^?1 的 61.95 ± 1.11% 和 250 μg·mL^?1 的 44.27 ± 4.08%；O. mascula 根提取物 0.1% 的抑制率为 12.96 ± 2.22%。阳性对照 thiourea 10 mM 的抑制率为 90.81 ± 2.61%，显著高于所有其他测试组。结果表明脲酶抑制活性呈浓度依赖性，O. mascula 来源 AgNPs 的脲酶抑制活性相对更强。

讨论与局限总结：研究人员将两种 Orchis 物种来源 AgNPs 的差异归因于植物提取物中植物化学组成不同，从而影响还原、封端和稳定过程。碱性 pH 可促进羟基和酚羟基等官能团去质子化，增强还原能力及其与银离子相互作用，改善纳米颗粒形成和胶体稳定性。DLS 中 zeta 电位绝对值低于通常 ±30 mV 高静电稳定阈值，但负值可限制聚集，且表面结合生物分子可提供空间稳定。FT-IR 仅提供表面官能团定性信息，不能鉴定具体植物化学物质，需 HPLC 或 GC–MS 进行分子水平表征。抗菌机制包括 AgNPs 附着并穿透细胞包膜、破坏膜完整性、诱导 ROS 以及干扰蛋白质和 DNA；但 ROS 升高并非普遍。抗氧化活性可能与 AgNPs 核心的电子转移和植物化学封端层提供表面电子供体有关。脲酶抑制可能涉及 AgNPs 与含硫基团结合、阻断尿素进入活性位点、空间位阻或去除脲酶所需镍。局限性包括：未进行比较植物化学谱分析；未使用 HRTEM 晶格条纹、单颗粒表征和详细粒径分布分析；缺乏不同储存条件下长期胶体稳定性研究及合成参数系统优化；尚未进行哺乳动物正常细胞毒性、毒理和生态毒理评价及体内研究；抗菌机制还需膜渗漏、脂质过氧化、ATP 耗竭、DNA 损伤和超微结构分析等补充；还需评估替代抗氧化实验、药代行为和放大可行性。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员利用 O. latifolia 和 O. mascula 的水溶性根提取物成功植物合成了 AgNPs。包括 UV–可见光谱、EDX、TEM、DLS、FT-IR、TGA、DSC 和 XRD 在内的联合表征结果证实形成了植物化学物质封端且具有晶态的 AgNPs，其理化性质存在差异。两种 Orchis 物种产生的 AgNPs 在水合粒径和表面特征方面存在差异，提示植物物种对纳米颗粒形成和稳定的影响。两种 AgNP 制剂均表现出广谱抗菌活性，而 O. mascula 介导的 AgNPs 总体上表现出更强的抗菌和脲酶抑制效果。相反，O. latifolia 介导的 AgNPs 表现出相对更高的 DPPH 自由基清除活性。流式细胞术分析进一步揭示 AgNPs 诱导微生物细胞活力改变，并在选定微生物中增加细胞内 ROS 生成，支持氧化应激和细胞损伤参与其抗菌活性。总体而言，研究结果表明亲缘关系较近的 Orchis 物种能够生成具有不同理化特征和生物学性能的 AgNPs，强调了绿色纳米技术中植物来源选择的重要性。这些结果为 O. latifolia 和 O. mascula 作为合成具有生物活性 AgNPs 的可再生来源的潜力提供了有价值的见解。