绿色合成Achyranthes aspera包覆CuO纳米颗粒的浓度依赖性纳米-生物相互作用及其抗氧化、抗菌与促细胞迁移潜能

《Next Nanotechnology》：Dose dependent nano bio interactions of green synthesized Achyranthes aspera capped CuO nanoparticles

　　

理解浓度依赖性纳米-生物相互作用对于开发安全且具有生物功能的纳米材料至关重要。本研究采用Achyranthes aspera叶提取物绿色合成铜氧化物纳米颗粒（CuO NPs），并评价其理化特征与生物活性。合成的CuO NPs呈半球形形貌、单斜晶体结构，粒径范围为8至35 nm，在296 nm处具有特征紫外-可见（UV–visible）吸收带。CuO NPs表现出浓度依赖性细胞相容性（cytocompatibility），细胞活力从25 μg mL^?1时的85.71%降至100 μg mL^?1时的69.82%，表明较低浓度下具有更高细胞相容性。抗氧化活性随浓度增加而增加，在200 μg mL^?1时达到93.32%。该纳米颗粒对Escherichia coli和Staphylococcus aureus也表现出浓度依赖性抗菌（antibacterial）活性。此外，划痕实验（scratch assay）表明在优化处理条件下细胞迁移增强。总体而言，研究结果表明，A. aspera包覆的CuO NPs具有浓度依赖性细胞相容性、抗氧化、抗菌和促细胞迁移特性，突出了其在伤口相关生物医学应用中进一步研究的潜力。

论文围绕绿色合成Achyranthes aspera包覆CuO纳米颗粒的浓度依赖性纳米-生物相互作用展开。研究背景方面，纳米技术可在纳米尺度精确调控材料，纳米材料因量子限域、较高比表面积和更高反应性表面而表现不同理化行为，并应用于药物递送、生物传感、环境修复、生物医学工程和抗菌等领域。金属氧化物纳米颗粒因结构一致性、可调表面化学和多种生物活性受到关注；其中铜氧化物纳米颗粒（copper oxide nanoparticles, CuO NPs）成本较低、来源丰富，具抗菌、抗氧化、催化和抗癌活性，在抗菌涂层、伤口愈合材料、生物传感器和靶向药物递送中具潜力。CuO NPs的纳米尺寸、大比表面积及Cu²⁺与Cu⁺之间的氧化还原可塑性有助于其生物活性，还原态Cu⁺可诱导活性氧（reactive oxygen species, ROS）形成，损伤细菌细胞壁并干扰代谢。但传统合成方法如化学还原、溶胶-凝胶和物理沉积使用有毒化学品且能耗较高，限制环境可持续性和生物医学适用性。植物提取物绿色合成因植物化学物可作为还原、封端和稳定剂，具有成本低、条件温和、生物相容性较高和生物性能改善等优势。Achyranthes aspera属Amaranthaceae，传统用于伤口管理、感染和炎症，含酚类、黄酮、萜类、脂肪酸衍生物和含氮代谢物，具还原、抗氧化和稳定特性。尽管其他植物提取物已用于CuO NPs合成，A. aspera介导CuO NPs及其理化特征、植物化学成分和浓度依赖性生物活性的系统关联仍有限。因此，研究人员开展本研究，旨在建立环境可持续合成方法，并评估CuO NPs的理化、植物化学和生物特性。研究结论表明，所合成CuO NPs具约17.9 nm纳米晶性，并具显著抗氧化、抗菌和伤口愈合相关特性，提示其在生物医学领域的应用潜力。

关键技术方法：研究人员采集印度泰米尔纳德邦Tirupattur District Naickanoor村（12°23′56.3″ N, 78°34′18.6″ E）的A. aspera L.叶，凭证标本Accession No. MCC/DOB/MCCH/24–25/06。以叶水提物介导绿色合成CuO NPs，并采用紫外-可见光谱（UV–visible）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、高分辨率扫描电子显微镜（HRSEM）、高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）、选区电子衍射（SAED）、动态光散射（DLS）和Zeta电位分析进行表征；以气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析植物化学成分。生物评价包括DPPH抗氧化、琼脂纸片扩散抗菌（E. coli和S. aureus获自SRM Medical College Hospital and Research Centre）、人红细胞溶血（人血实验经IEC No. 9098; Registration No. ECR/431/Inst/TN/2013/RR-24批准，并获知情同意）、MTT细胞活力和划痕实验。

研究结果如下。

3.1 形貌分析：研究人员通过显微和元素分析评估了绿色合成CuO NPs的形貌、尺寸和纯度，结果表明颗粒呈近球形、单斜CuO相，并存在植物化学封端导致的局部团聚。

3.1.1 高分辨率扫描电子显微镜：HRSEM显示CuO NPs近球形，形状和尺寸分布较均匀，平均直径约30 nm，与XRD平均晶粒尺寸17.92 nm相符；存在局部团聚和簇集，原文归因于范德华力和分子间氢键及植物化学封端剂作用。元素分析显示Cu为主要元素，特征峰位于0.9 keV（Lα）、8 keV（Kα）和9 keV（Kβ），并见O及来自A. aspera提取物残留植物化学物的C，无额外元素峰，提示纯度较高。

3.1.2 高分辨率透射电子显微镜：HRTEM显示CuO NPs主要为准球形至略多面体，分布中等，干燥过程中有轻微团聚；粒径8至35 nm，平均约30 nm，与HRSEM一致。SAED显示多晶衍射环，对应XRD所示单斜CuO相晶面；EDX见Cu和O峰，无杂质峰，背景微弱信号可能来自碳包覆铜网。酚类、羰基和胺基代谢物吸附于纳米颗粒表面，阻止不受控生长和团聚。

3.2 X射线衍射分析：XRD在2Θ为32.48°、35.50°、38.76°、48.74°、53.46°、58.31°、61.53°、66.03°、68.05°、72.40°和75.09°处出现明显Bragg反射，分别对应（110）、（-111）、（111）、（-202）、（020）、（202）、（-113）、（-311）、（220）、（311）和（004）晶面，与JCPDS卡No. 89–2529的CuO（tenorite相）一致，表明合成相纯CuO。Debye–Scherrer方程计算平均晶粒尺寸为17.92 nm，确认纳米尺度。

3.3 傅里叶变换红外光谱分析：FTIR显示3215.34 cm^?1宽羟基吸收带，来自酚类、多糖和醇类，可参与Cu²⁺还原和表面吸附稳定；2349.45 cm^?1为OCO基团不对称伸缩，提示吸附碳酸盐；2113.98 cm^?1为CCO（ketene）伸缩；1998.61 cm^?1和1886.38 cm^?1为芳香族和脂肪族C-H弯曲；1627.92 cm^?1为C=O伸缩，来自黄酮和酚类衍生物；1180.44 cm^?1为C-O伸缩；500–600 cm^?1为Cu-O伸缩，支持单斜CuO晶格形成。

3.4 紫外-可见光谱：UV–visible光谱在296 nm处显示清晰强吸收峰，表明CuO纳米结构形成且Cu²⁺转化有效。原文指出溶液pH控制成核、生长和CuO NPs特征，pH 8为CuSO₄转化为CuO NPs的优化条件；此pH下A. aspera提取物中酚羟基部分电离，增强电子供体能力，通过电子转移还原Cu²⁺，并借助氧化植物化学物吸附提供表面和静电稳定。

3.5 动态光散射：DLS显示CuO NPs在水相中分散良好，流体力学尺寸为50–300 nm；该尺寸包括CuO无机核和周围植物化合物层，反映胶体悬浮中的真实粒径。粒径分布图显示较均匀分散，无明显大规模聚集体，聚分散指数（PDI）低于1，提示中等且可接受的尺寸分布。

3.6 Zeta电位：Zeta电位为?7.23 mV，表明液体悬浮中纳米颗粒具中等负表面电荷。该值低于常认为的±30 mV高稳定性范围，提示存在颗粒聚集，与HRSEM和DLS观察一致；但A. aspera中酚类、萜类、黄酮和氨基化合物在纳米颗粒表面形成天然有机 corona，提供空间稳定。负电荷来自羟基和羧基去质子化，除表面负电性外还形成空间屏障，故在低Zeta电位下仍保持一定稳定和均匀分散。原文与Momordica charantia叶提取物合成CuO NPs的?5.90 mV胶体行为进行比较。

3.7 GC-MS分析：GC-MS分析A. aspera甲醇提取物，鉴定出50种以上化合物，色谱峰主要分布于7–24 min。主要化合物包括N,N-dimethylglycine、3-cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)-、succinic acid, 2-methylpent-3-yl tetrahydrofurfuryl ester、3,5-bis(1,1-dimethylethyl)phenol、2-nonadecanone、eicosanoic acid methyl ester、(Z)-6-octadecenoic acid methyl ester、S-[2-[N,N-dimethylamino]ethyl]-N,N-dimethylcarbamoyl thiohydroximate、2-((prop-2-ynyloxy)carbonyl)benzoic acid和neophytadiene。富电子分子如N,N-dimethylglycine和取代酚可通过胺和羟基转移电子，将金属离子Mⁿ⁺转化为零价M⁰，促进纳米颗粒形成；neophytadiene、脂肪酸甲酯等疏水或两亲分子通过烯烃和酯基吸附于纳米颗粒表面，形成有机封端层，提供空间位阻并防止聚集。

3.8 抗氧化测定：DPPH自由基清除法显示，CuO NPs在25至200 μg mL^?1范围内呈浓度依赖性抗氧化活性。25 μg mL^?1时抑制率为6.28%，低于阳性对照抗坏血酸31.30%；随浓度增加，抑制率为28.15%、53.99%、64.5%和93.32%（对应50、75、100和200 μg mL^?1），200 μg mL^?1时与抗坏血酸接近。IC₅₀为71.14 μg/mL，显示中等自由基清除能力。517 nm吸光度降低表明DPPH^•自由基被有效猝灭，机制涉及电子转移或氢供体，并可能与Cu²⁺/Cu⁺氧化还原循环及表面植物化学物协同有关。

3.9 抗菌测定：采用琼脂纸片扩散法评价CuO NPs对E. coli和S. aureus的抗菌活性，gentamicin为阳性对照。E. coli在25 μg mL^?1时抑制圈8 mm，至100 μg mL^?1时增至19 mm；S. aureus呈相似趋势，提示广谱抗菌作用。虽然抑制圈小于gentamicin约26 mm，但随浓度增加杀菌效果增强。机制包括Cu²⁺/Cu⁺氧化还原循环诱导胞内ROS、芬顿反应、脂质过氧化、蛋白氧化和DNA损伤；CuO NPs因纳米尺寸和大比表面积可与带负电细菌壁静电作用，破坏膜通透性，释放Cu²⁺干扰代谢酶、抑制ATP合成和细胞呼吸，并可能穿过膜造成氧化损伤。绿色合成CuO NPs因A. aspera植物化学封端剂改善稳定性、分散性和表面活性，较化学合成材料显示更强抗菌活性。

3.10 溶血：使用人红细胞（human red blood cells, hRBCs）在25、50、75和100 μg/mL浓度下评价血液相容性。阴性对照溶血可忽略（0.253%），阳性对照完全溶血。CuO NPs溶血率随浓度增加而增加：25 μg/mL为4.59%，50 μg/mL为13.94%，75 μg/mL为20.84%，100 μg/mL为25.15%。按ISO 10993–4，25 μg/mL为非溶血，100 μg/mL为轻微溶血。相对受控的溶血活性可能归因于表面结合植物化学物降低CuO NPs与红细胞膜的直接相互作用。

3.11 细胞活力测定：MTT法检测成人真皮成纤维细胞活力。随CuO NPs浓度增加，细胞存活率下降：25 μg/mL为85.71%，50 μg/mL为79.10%，75 μg/mL为75.94%，100 μg/mL为69.82%；IC₅₀预计大于100 μg/mL，显示一定的毒性控制。绿色合成CuO NPs较化学合成CuO NPs非特异毒性较低，因表面结合生物分子改善生物相容性。

3.12 划痕实验：划痕实验检测成人真皮成纤维细胞迁移。0 h时各组划痕宽度一致；24 h后对照组有一定基础迁移，CuO NPs处理组划痕闭合更明显，且随浓度增加而增强，100 μg/mL时作用显著并伴有更多细胞浸润伤口区域。原文讨论指出，低剂量CuO NPs可通过ROS介导ERK通路激活促进成纤维细胞迁移；生物合成CuO NPs在亚致死浓度下可通过刺激细胞骨架重塑和上皮-间质转化（EMT）相关信号分子增强伤口闭合。

讨论与结论：原文讨论强调，A. aspera功能化CuO NPs通过氧化还原介导的纳米-生物界面相互作用影响细胞行为；表面植物化学封端层与CuO自身氧化还原活性共同调节细胞相容性、抗氧化、抗菌和细胞迁移。较低浓度显示较好细胞相容性，较高浓度抗氧化和抗菌活性增强，但溶血和细胞毒性也随浓度上升。结论翻译如下：本研究提供机制证据，表明Achyranthes aspera功能化的CuO纳米颗粒通过氧化还原介导的纳米-生物界面相互作用主动影响细胞行为。绿色合成策略使稳定的纳米级CuO颗粒得以形成，其具有适合生物医学应用的有利理化特征。生物学研究表明，植物化学功能化纳米颗粒表面在调控胞内氧化平衡中起关键作用，从而影响与细胞相容性、蛋白稳定、膜完整性和适应性细胞反应相关的细胞信号通路。观察到的浓度依赖性细胞相容性表明，受控纳米颗粒暴露可在维持可接受细胞耐受性的同时保留生物功能。重要的是，强抗氧化活性表明这些纳米颗粒能够调节ROS稳态，而ROS稳态是生物材料界面处炎症、氧化应激反应和组织再生的重要控制因素。划痕实验中增强的细胞迁移进一步表明，这些纳米颗粒可能参与细胞骨架重组和与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关的细胞动力学，而这些对伤口修复过程至关重要。此外，对革兰阳性和革兰阴性细菌菌株均具有显著抗菌活性，证明合成纳米颗粒具有降低生物医学环境中微生物定植和感染风险的潜力。抗菌机制可能与微生物界面的膜扰动和氧化损伤有关。这些研究表明，合成CuO NPs在抗菌伤口敷料配方、抗菌涂层和其他局部生物医学应用中具有应用潜力。未来需要进行进一步的体内研究，以评估合成CuO NPs的安全性、生物相容性、治疗功效、药代动力学和长期毒性，然后才能将其转化为实际生物医学应用。