实用的改良Biel水迷宫大鼠学习和记忆筛查测试——多中心验证

《Neurotoxicology and Teratology》：A practical learning and memory screening test in rats using a modified Biel water maze – A multi-site validation

　　

• 使用改良版Biel水迷宫（BWM）筛选学习和记忆（L&M）功能缺陷
• 反向路径和红光灯条件增加了任务复杂性和检测敏感性
• 该范式在7个实验中心得到验证，具有持续一致、可重复的测试表现
• 该范式对幼年大鼠（出生后第25天±2天）的学习和记忆功能缺陷具有敏感性
• 单一范式可适用于幼年、成年及成熟大鼠

引言

在异生物质暴露后进行成年神经毒性测试，数十年来一直是安全性评估指南的重要组成部分（EPA, 2009）。同样，在发育毒性研究中，F1代子代的功能神经发育评估也被纳入其中，涵盖宫内期和哺乳期暴露后的检测（EPA, 2011; ICH, 1913）。神经行为学测试组合中的一个关键组成部分是对学习和记忆（L&M）功能的评估，出于显而易见的原因（如体型大小、自然探索行为，以及在统计评估中纳入较大样本量的可能性），这通常在啮齿类动物中进行。尽管在化学品监管指南中已列出多种学习和记忆测试作为示例（如被动回避、嗅觉条件化、Morris水迷宫（MWM）、Biel水迷宫（BWM）或辛辛那提水迷宫（CWM）、以及径向臂迷宫（RAM）），但直到最近，没有任何指南明确要求在这些评估中使用某种特定类型的测试。在过去5年内更新的药品研发指南（ICH, 2020a, ICH, 2020b）仍然表述了对"复杂的"学习和记忆测试的要求，但未具体说明应采用何种复杂学习任务或测试类型。需要注意的是，OECD TG 426和EPA OPPTS 870.6300指南在选取学习和记忆测试时列出了2项具体标准：(1) 学习应作为多次重复学习试验或会话间的变化来进行评估，或者在涉及单次试验的测试中，应与一个控制训练经历非关联效应的对照条件进行比较；(2) 测试应包含除原始学习（获得）之外的某些记忆度量（短期或长期记忆）（EPA, 2011; OECD, 2007）。OECD TG 426进一步扩展了这些标准，指出记忆度量不能在没有来自同一测试的获得度量报告的情况下单独报告。因此，工业实验室历来可以自由开发和验证符合上述标准的特定学习和记忆测试。因此，安全性评估行业中使用各种不同设备、条件和测试范式的情况也就不足为奇了。

2022年，欧洲化学品管理局发布了《生物杀灭产品法规》指南（ECHA, 2022）。该法规要求在青春期（出生后第25天±2天）和青年期（出生后第60天及以上）进行联想学习和记忆测试，并建议使用不同组别的动物在每个年龄段分别进行测试。尽管该指南经常引用OECD发育神经毒性（DNT）研究测试指南（TG 426），但它更进一步，引用了预期使用的迷宫类型要求，并包括动物年龄和测试条件。该指南列出了在较年轻年龄评估地心（空间）学习和记忆时使用的MWM和RAM，以及在较大龄动物中调查自我中心（导航）学习和记忆时使用的CWM。对于后者，也可以使用嗅觉条件化测试或日程控制行为保持测试。该指南指出，包括原始BWM（Biel, 1940）在内的其他测试不应被选用，因为根据在监管使用中的实践经验，这些测试被认为对检测发育性神经毒素不敏感（ECHA, 2022）。因此，看起来，原始OECD TG 426和此前指南文件中提到的测试选择的灵活性，现在正遭到否弃，至少在欧盟生物杀灭产品的注册方面是如此。值得注意的是，ECHA指南文件指出，"(CWM)测试在红外光下使用的延长时长可能限制其在监管研究中的适用性。"因此，在监管安全性评估研究中仅指定使用CWM进行自我中心学习和记忆评估的合理性和实际可行性值得进一步讨论。

本文的主要目的是解决BWM对筛选发育性神经毒素的所谓敏感性不足的问题，并开发一种以自我中心学习和记忆为重点、适用于监管安全性评估研究中多个年龄阶段的实用筛查测试范式，同时保持操作上可行。本文献中展示的数据是使用阳性对照和多个Charles River设施中协调一致的测试范式生成的，以证明可重复性和实验室间的可靠性。

自其最初开发以来，水迷宫已被广泛应用于学术和工业实验室的学习和记忆评估中，其中MWM、BWM和CWM是最常用的。对于动物来说，要能够解决迷宫问题，需要具备导航能力，这可以细分为两种主要类型的学习：地心导航和自我中心导航。在地心（空间）导航中，动物使用来自周围环境的外部（远端）视觉线索，这些线索主要由海马和杏仁内侧皮层处理，并参与基于地图的学习（Vorhees and Williams, 2016）。MWM经常被用于评估地心导航。

在自我中心导航中，动物使用内部（近端）线索，以自我为导向的方式，涉及背侧纹状体、海马和丘脑。这要求动物做出左/右转向，通常被称为基于路线的学习。BWM和CWM是最常用于测试自我中心导航的迷宫。无论哪种类型的导航，即使同一水迷宫在多个工业实验室中使用，可能也是在各种测试条件下使用，并配合各自独立开发的测试范式。这些变量的综合（测试类型、测试范式复杂程度等）使得在不同研究之间以及不同工业实验室之间比较和对比数据集变得困难，从而增加了从监管角度看这些测试的敏感性和相关性的不确定性。

BWM和CWM是序列学习测试，由于这一特性，根据《北美自由贸易区农药技术工作组》DNT研究指南文件（EPA, 2016）的说明，它们被认为是复杂的。序列学习描述了动物逐一数据实例（试验）地强化其知识，学习通过自我中心线索（一系列身体转向运动）到达目标平台所必需的动作序列（左/右转向）、减少错误，并使这些动作变得"习惯化"的认知过程。这种习惯学习涉及背侧纹状体（Schmitzer-Torbert and Redish, 2004）。

BWM最初由William Biel开发（Biel, 1940），随后被广泛应用于使用不同范式和在不同条件下对啮齿类动物的学习和记忆进行测试（Akaike et al., 1994; Butcher et al., 1970; Cruzan et al., 2005; Faber et al., 1907; Kihara et al., 1995; Mineshima et al., 2022; Polidora et al., 1966a, Polidora et al., 1966b; Stump et al., 2010; Tsutsumi et al., 1998; Vorhees et al., 1978）。它包含5个T形死胡同通道和直通道末端的一个额外死胡同通道，起点和目标平台之间共有6个选择点（图1）。CWM由Charles Vorhees博士作为BWM的改编版本开发，旨在增加学习任务的整体复杂性（Vorhees, 1987）（图1）。两种迷宫最准确的描述都是多重T形迷宫，其中动物需要通过一系列左或右转向来导航迷宫以到达目标平台，动机的提供来自于逃离水中的机会。关于多重T形迷宫（包括BWM）的发展和应用的详尽历史，可在文献中找到（Paul et al., 2009; Vorhees and Williams, 2024, Vorhees and Williams, 2016）。尽管这两种迷宫已成功用于在DNT测试背景下评估暴露对神经系统的影响（Biesemeier et al., 2011; Braun et al., 2012; Butenhoff et al., 2009; Cruzan et al., 2005; Faber et al., 2007; Pitt et al., 2000; Sheets et al., 2016; Stump et al., 2010; Vorhees et al., 1991），但CWM在安全性评估研究中的使用却十分有限（Vorhees and Williams, 2024）。

在此，我们讨论一些影响BWM在监管安全性评估中采用和广泛应用的关键因素。在Dr. Vorhees开发CWM时，他建议通过增大迷宫尺寸并添加3个额外的T形死胡同通道（CWM中共有9个T形通道）（图1）来增强原始BWM的复杂性（Vorhees, 1987）。其他担忧，如游泳通道的宽度，也在CWM及后续使用BWM的出版物中得到了解决，以防止动物以不恰当的方式逃离迷宫（即在非目标位置逃离）。这些修改也被期望能增加迷宫检测处理相关缺陷的敏感性。在后续出版物中，作者向迷宫中添加了一个第10个T形通道以增加任务长度和难度（Vorhees and Williams, 2016），并详细讨论了大鼠解决迷宫的策略。就背景而言，有建议指出大多数大鼠使用"直行游泳直到被迫转向的策略"，即直到它们遇到垂直墙壁来驱动向左或向右转弯的决策。在原始BWM路径中（Biel, 1940），在6个可能的转弯中有5个，动物有50:50的概率朝正确方向转弯（图2）。在CWM中，Vorhees和Williams测试了两条可能的游泳路径（Vorhees, 1987; Vorhees and Williams, 2016）。在一个方向上，在全部9个转弯处，动物都有50:50的概率朝正确方向转弯。在反向路径中，被认为更复杂，动物在到达垂直墙壁之前就被迫做出转弯选择，即前述的"直行游泳直到被迫转向的策略"总是导致2次错误选择（当动物进入T形通道时由于死胡同死端所致）。Polidora等人首次使用BWM测试了反向路径，他们注意到与原始路径相比，动物在反向路径游泳时错误更多（Polidora et al., 1966a, Polidora et al., 1966b）。BWM中的反向路径随后通过Butcher等人（1970）的工作得到了验证。综合而言，这些作者提供了证据支持BWM中的反向路径比原始路径更复杂。

本文献侧重于利用使用与Biel（1940）所用路径相反的路径的改良版BWM，此处后文称为反向路径，以增加BWM中学习任务的复杂性。通过这一方向反转，动物在6个可能的转弯中有5个被要求在到达垂直墙壁之前做出向左或向右转弯的选择（图2），即前述的"直行游泳直到被迫转向的策略"导致动物在83%的情况下做出错误选择并进入死胡同通道。

为了评估该检测方法的灵活性范围（资源配置和/或实验室设置），开发并测试了两个BWM反向路径测试范式选项，测试对象为适当年龄的未处理留种动物（表1）。随后在7个不同的Charles River设施进行了该检测；每个设施仅评估两种范式之一。两种范式选项均包含3个步骤：(1) 一系列评估游泳（S）能力的试验，(2) 一系列学习试验（T1至T5），以及(3) 单次记忆试验（T6）。

第一步在学习试验开始前一天（第1天）进行，由4次连续直通道游泳组成（在S和G'之间），闸门关闭以防止进入完整迷宫（图1）。这些试验的目的是让动物接触并适应水环境，验证各组动物的正常游泳能力，并且由于这些试验使动物了解到逃脱是可能的（Skelton et al., 2008）。

每只动物有 2 分钟时间在直线通道的另一端找到目标平台。如果大鼠未能在限定时间内找到平台，则将其从水中捞出并由技术人员放置在平台上数秒钟。逃脱迷宫的时间延迟和移动距离通过自动化视频追踪系统（ANY-maze，Stoelting Co.，Wood Dale, IL, USA 或 EthoVision XT，Noldus，Wageningen，荷兰）进行记录。第二步包括总共进行 5 次学习试验，分一天或两天完成（表 1）。在学习（和记忆）试验期间，所有变量（例如测试室内的可见地标以及技术人员相对于迷宫的位置）均保持恒定，无论动物进入迷宫前后，在每次试验开始时均如此。每只动物被放置在起始位置的水中（闸门打开，使其能够访问整个迷宫）。该测试的目的是让动物找到目标平台。如果大鼠未能在 3 分钟的规定时间内找到逃生平台，则将其移除，并视为该次试验失败。不允许重新测试或协助其到达目标。逃脱时间、错误次数以及移动距离（数据未显示）均通过指定的自动化视频追踪系统进行记录。每次动物的中心点（由已验证的视频追踪软件计算的质心）进入一个已定义的错误区域时，即被计为一个错误（图 2）。如果动物在 T 型结构的两个臂之间来回游动，则每次进入新的错误区域时均被记录为一个错误。以下情况将个体动物/试验排除在统计分析之外：(a) 动物从非目标位置逃脱迷宫，以及 (b) 存在追踪伪影的动物（例如，由于动物在水下游泳）。大约一周后（即第 9 天），第三步包括进行一次记忆探针试验，其进行方式与学习试验相同。再次强调，如果大鼠未能在 3 分钟内找到平台，则将其移除，视为该次试验失败，且不允许重新测试或提供协助。逃脱时间、错误次数和距离的记录方式与学习试验相同。由于在方法开发过程中获得了可重复的结果（数据未显示），无论使用哪种测试范式选项，均可用于在 Charles River 的 7 个设施进行阳性对照验证研究（表 2）。

主题片段

受试者
用于一般、生殖和青少年毒理学研究的常规雄性及未生育雌性大鼠，包括 Sprague Dawley IGS (Crl:CD(SD)) 和 Wistar Han IGS (Crl:WI(Han))，均采购自 Charles River Research Models and Services（北卡罗来纳州、英国或法国）。在不同设施中使用了 3 个年龄组的动物：青少年（25 ± 2 天）、青年期（8–12 周）和成熟期（14 周）（表 2）。动物通过皮下植入的电子方式识别。

结果
所有被选中进行测试的动物均存活至计划安乐死；雄性和雌性的平均体重与相应年龄匹配的历史对照数据一致，且各组之间无明显差异。所有处理组、年龄组和大鼠品系中，雄性和雌性的游泳能力逃脱时间平均值（数据未显示）相似。

讨论
本文的主要目标是开发一种实用的筛查范式，以促进自我中心学习，并适用于在监管评估环境中使用的大鼠的多个年龄段，同时解决 BWM 据称不敏感的问题 [正如 ECHA《生物杀灭产品法规》指南中所指出的 (ECHA, 2022)]。虽然该范式倾向于自我中心学习，但由于实验是在红光下进行的（并非完全黑暗环境），大鼠可能也能够利用……

结论
学习和记忆 (L&M) 的评估是发育期和成人神经毒性研究中的一个关键终点。监管指南和指导文件要求在青春期（出生后第 25 ± 2 天 [PND]）和成年早期（PND 60 天及以上）对啮齿动物进行联想 L&M 测试，并建议使用不同组的动物在每个年龄进行测试。据我们所知，没有其他水迷宫（如 Cincinnati (CWM) 或）的使用已发表报告。

CRediT 作者贡献声明
Pragati S. Coder: 撰写 – 审阅与编辑，可视化，项目管理，方法论，调查研究，形式分析，数据管理，概念构思。Edward Marsden: 撰写 – 初稿，方法论，调查研究，概念构思。Donald G. Stump: 撰写 – 审阅与编辑，方法论，调查研究，概念构思。Nacera Mellal: 形式分析。Stephanie Clubb: 方法论，调查研究，概念构思。Francois van Otterdijk: 方法论，调查研究，

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

致谢
作者感谢 C. Verchere Beau 对该范式的初步开发和测试。作者还感谢参与此次多中心工作的 Charles River 技术运营团队的努力工作、协作和技术专长，特别是 C. Bennie, C. Bory, C. Morand, C. Sands, E. M. Lewis, E. Marco-Gregori, H. M. Toy, J. Barnett Jr., J. Bowen, K. de Haas – Willems, M. B. Bennett, M. T. Herberth, P. Goldsteen, R. Broderick, S. Barbeau, T.

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