高硝酸盐与低硝酸盐蔬菜摄入对老年人氧化还原、炎症及心脏代谢标志物的影响：一项随机交叉试验

《Nitric Oxide》：High- and low-nitrate vegetable intake produce similar effects on redox, inflammatory, and cardiometabolic markers in older adults: a randomized crossover trial

　　

富含水果和蔬菜的膳食模式与老年人群慢性疾病风险降低密切相关，这些保护作用归因于具有抗氧化特性的生物活性化合物。绿叶蔬菜是无机硝酸盐的主要膳食来源，而硝酸盐是一氧化氮（NO）的前体，参与血管功能和氧化还原稳态调节。然而，尚无随机对照试验直接比较高硝酸盐（HN）与低硝酸盐（LN）蔬菜对老年人氧化还原生物标志物的影响。本研究旨在确定，与LN蔬菜相比，HN蔬菜的摄入是否会对社区居住的60–75岁老年人的血清总抗氧化能力（sTAC）产生不同影响，次要目标是比较两种蔬菜对多种抗氧化酶活性、氧化损伤标志物、全身性炎症标志物以及心脏代谢危险因素的影响。这是一项随机、对照、交叉设计膳食干预试验，共纳入42名参与者，完成两个为期7天的干预期，中间间隔7天洗脱期。研究人员发现，HN蔬菜显著提高了血浆和尿液中硝酸盐/亚硝酸盐（NOx）浓度，证实了良好的依从性。然而，在sTAC或任何次要结局指标上均未观察到显著的组间差异，效应量始终较小（|d|≤0.4）。尽管HN饮食的膳食总抗氧化能力（dTAC）显著高于LN饮食，但这并未转化为sTAC的更大改善。对于收缩压（SBP）和甘油三酯-葡萄糖（TyG）指数，观察到的微小效应方向有利于HN饮食。研究表明，在营养密集型膳食的社区居住、身体活跃的老年人中，与LN蔬菜相比，未检测到富硝酸盐蔬菜对全身氧化还原、炎症或心脏代谢状态的显著增量贡献。这一发现适用于提供多种生物活性化合物的完整蔬菜基质，而非单独的硝酸盐。由于样本量有限，研究结果应被视为假设生成性质。富硝酸盐蔬菜的临床相关性可能在身体表现和认知功能等功能性和行为性结局中更为明显，或在血管或代谢功能受损的人群中更为突出，这需要在更长干预期的专门试验中进行研究。

研究背景与目的

慢性疾病和衰老与氧化应激状态密切相关，活性氧（ROS）过量产生会超过内源性抗氧化防御能力，导致分子损伤并激活促炎转录因子。大量前瞻性队列研究和荟萃分析显示，水果和蔬菜摄入量与心血管疾病（CVD）风险之间存在剂量反应关系，其中绿叶蔬菜的保护关联最为显著。绿叶蔬菜是无机硝酸盐的主要膳食来源，硝酸盐作为一氧化氮（NO）的前体，在血管功能和氧化还原稳态中发挥关键作用。NO可通过经典的L-精氨酸-一氧化氮合酶（NOS）途径合成，也可通过硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径生成，即膳食硝酸盐（NO₃^?）经口腔共生菌还原为亚硝酸盐（NO₂^?），再在多种组织中进一步还原为NO。在ROS过度产生的条件下，NO生物利用度降低，损害其保护性血管和氧化还原信号功能。老年人由于NOS功能障碍和口腔微生物群组成改变，NO生物利用度下降，可能进一步加剧年龄相关的血管功能障碍和氧化应激。

目前尚无随机对照试验直接比较高硝酸盐（HN）和低硝酸盐（LN）蔬菜对老年人氧化还原生物标志物的影响。现有针对该人群的试验和系统综述主要集中在血压而非氧化应激标志物，且所有评估硝酸盐与老年人氧化还原状态的研究均依赖甜菜根汁或无机硝酸盐盐类，而非完整蔬菜，结果也不一致。此外，HN蔬菜还提供多酚、类胡萝卜素和维生素等多种生物活性化合物，可能协同贡献于全身抗氧化能力。血清总抗氧化能力（sTAC）整合了循环中所有抗氧化化合物的联合作用，是检测整体膳食干预后氧化应激变化的敏感标志物。

本研究的主要目的是确定，与LN蔬菜相比，HN蔬菜的摄入是否会对社区居住的60–75岁老年人的sTAC产生不同影响。次要目标是比较两种蔬菜对多种抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx和谷胱甘肽S-转移酶GST）、氧化损伤标志物（丙二醛MDA和蛋白质羰基）、全身性炎症标志物（白细胞介素-6 IL-6和白细胞介素-10 IL-10）以及心脏代谢危险因素（包括血压、血脂谱和通过TyG指数评估的胰岛素抵抗）的影响。

研究方法与技术

本研究采用随机、对照、交叉设计，于2023年6月至2024年6月在巴西巴西利亚大学健康科学学院营养生物化学实验室进行。研究人员通过滚雪球抽样招募了42名参与者（男性和女性），最终39人纳入分析。纳入标准为60–75岁成年人，体重指数（BMI）19–29.9 kg/m²，非吸烟者。排除标准包括肥胖、酗酒、使用干扰硝酸盐-亚硝酸盐-NO通路的药物等。参与者完成两个为期7天的干预期，分别食用HN蔬菜（甜菜根、菠菜、生菜、芝麻菜、羽衣甘蓝、瑞士甜菜和水芹）或LN蔬菜（番茄、胡萝卜、黄瓜、卷心菜和西兰花），每日250克，中间间隔7天洗脱期。主要技术方法包括：使用分光光度法测定蔬菜硝酸盐含量；通过酶促还原结合格里斯反应测定血浆和尿液中的总硝酸盐和亚硝酸盐（NOx）；采用FRAP法测定sTAC；使用标准分光光度法测定CAT、GPx、GST和SOD活性；荧光法测定MDA，分光光度法测定蛋白质羰基；酶联免疫吸附试验（ELISA）定量血清IL-6和IL-10；酶促比色法测定血脂谱；基于空腹血糖和甘油三酯计算TyG指数。统计分析采用线性混合效应模型，调整周期、序列、基线膳食协变量和干预前值。

研究结果

参与者特征与依从性：最终分析的39名参与者中，女性占61.5%，男性占38.5%，平均年龄67±4.3岁，BMI 25.4±2.7 kg/m²。大多数参与者报告无或仅有一种慢性病，主要为高血压（35.9%）和高胆固醇血症（15.4%），82%使用至少一种药物。参与者根据美国医学研究所（IOM）标准属于身体活跃人群。实验室分析显示，HN蔬菜每日实际硝酸盐含量为431.5±163.6 mg，低于参考数据库的估计值（547 mg/天）。两组依从性均较高（HN 93%，LN 96%）。膳食记录显示，两组的蔬菜摄入量增加幅度相似，但HN期间的膳食硝酸盐摄入量和膳食总抗氧化能力（dTAC）均显著高于LN期间。

NOx生物标志物验证：HN饮食显著增加了血浆NOx（变化量Δ: +38.8 μmol/L；95% CI: 35.3至42.4；p<0.001）和尿液NOx（Δ: +1770.7 μmol/L；95% CI: 1400.7至2140.6；p<0.001），而LN饮食未引起显著变化。两组间的差异显著，证实了良好的依从性。

主要与次要结局：在主要结局sTAC或任何次要结局指标上均未观察到显著的组间差异（所有p>0.05）。组间比较的效应量始终较小（|d|≤0.4），最大的效应见于GST（|d|=0.40）、TyG指数（|d|=0.32）和收缩压SBP（|d|=0.28）。调整年龄、性别和BMI的敏感性分析与主要模型结果一致。由于检测试剂盒可用性限制，细胞因子在减少的亚组中分析（IL-6 n=18；IL-10 n=35）。

携带效应分析：CAT、MDA和蛋白质羰基检测到序列效应，提示可能存在携带效应。仅限于第一个干预期（视为平行组设计）的敏感性分析确认了CAT的主要零发现（p=0.172），并揭示了MDA的显著组间差异（p=0.044，有利于HN）和蛋白质羰基的显著组间差异（p=0.026，有利于LN）。

讨论与结论

本研究发现，尽管HN和LN蔬菜产生了显著不同的硝酸盐暴露水平，但这种差异并未转化为任何氧化还原、炎症或心脏代谢结局的显著组间差异，效应量始终为小到微不足道。这一结果与先前比较HN与LN蔬菜干预的试验一致，这些试验也未观察到血管或代谢标志物的显著差异，尽管血浆NOx大幅升高。

研究人员讨论了可能导致相似结果的几个相互关联的因素。首先，参与者是社区居住、身体活跃且习惯性蔬菜消费较高的老年人，其基线dTAC已高于其他巴西老年人群样本，表明全身抗氧化系统可能已处于稳态平衡，短期膳食修饰难以进一步改善。其次，两种干预都大幅增加了总蔬菜摄入量（中位数>140 g/天），提供了硝酸盐以外的多种生物活性化合物，这可能减弱了硝酸盐对抗氧化和炎症标志物的增量贡献。值得注意的是，HN饮食更高的dTAC并未转化为sTAC的更大改善，这可能反映了上述内源性调节机制以及dTAC估算的固有局限性。

尽管总体效应减弱，但仍观察到GST、SBP和TyG指数的小幅组间差异。GST活性在HN期间下降而在LN期间保持稳定，这可能反映了较低的外源物质暴露而非抗氧化防御受损。SBP的效应（Δ: -4.3 mmHg）超过了被认为具有人群水平临床意义的≥3 mmHg阈值，接近与大型荟萃分析中主要心血管事件约10%降低相关的5 mmHg阈值，提示如果在充分效力的试验中得到确认，可能具有潜在临床意义。检测这种效应大小所需的样本量估计为GST约40人，TyG指数约62人，SBP约81人。

研究优势包括使用完整蔬菜而非补充剂增强了生态效度和膳食实践相关性，直接实验室量化蔬菜硝酸盐含量减少了暴露分类错误，同时评估了全面的氧化还原和心脏代谢生物标志物面板。局限性包括缺乏双盲和硝酸盐限制的导入期，细胞因子数据不完整，参与者身体活跃的概况限制了向久坐人群的推广性，HN干预更高的dTAC使得无法将观察到的效应完全归因于硝酸盐，以及适度的样本量限制了检测小效应的统计效力。

研究结论：在营养密集型膳食的社区居住、身体活跃的老年人中，与低硝酸盐蔬菜相比，未检测到富硝酸盐蔬菜对全身氧化还原、炎症或心脏代谢状态的显著增量贡献。这一发现适用于提供多种生物活性化合物的完整蔬菜基质，而非单独的硝酸盐。鉴于样本量适中，研究结果应被视为假设生成性质。富硝酸盐蔬菜的临床相关性可能在身体表现和认知功能等功能性和行为性结局中更为明显，或在血管或代谢功能受损的人群中更为突出，这需要在更长干预期的专门试验中进行研究。