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镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）是一组严重的遗传性红细胞疾病，造成重大的全球医疗负担。尽管近年来基因治疗和干细胞移植取得了进展，但治疗选择仍然非常有限，凸显了开发新治疗策略的迫切性。人类SCD红系模型系统代表了通过药物筛选和机制研
镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）是一组严重的遗传性红细胞疾病，造成重大的全球医疗负担。尽管近年来基因治疗和干细胞移植取得了进展，但治疗选择仍然非常有限，凸显了开发新治疗策略的迫切性。人类SCD红系模型系统代表了通过药物筛选和机制研究来发现疾病修饰策略的新兴工具。本综述描述了可用的模型范围，包括患者来源的红细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞和永生化细胞系，并总结了它们各自的优势和劣势，以及它们与更复杂的整合共培养和类器官模型潜在整合的可能性。总体而言，这些细胞系统代表了可供SCD研究人员使用的不断扩大的工具包，具有减少对动物模型依赖的潜力。
**引言**
镰状细胞病（SCD）是一组以β-珠蛋白基因功能获得性突变（HBB:c.20A>T, p.Glu7Val）为特征的疾病，该突变产生镰状血红蛋白（HbS）。SCD的病理源于HbS在脱氧状态下易聚合，从而损伤红细胞，进而导致血管闭塞和溶血，并引发一系列相互关联的下游事件，包括贫血、组织梗死、炎症、低氧血症、氧化应激、高凝状态、血管内皮功能障碍、感染和器官损伤。SCD以急性发作和进行性器官损伤为特征，导致预期寿命缩短。在低收入地区，大多数SCD患者死于儿童期。目前SCD的治疗选择非常有限，羟基脲是唯一有效的疾病修饰药物。干细胞治疗虽取得重大进展，但仍价格昂贵，对大多数患者不可及。在SCD研究中，过去严重依赖表达人类血红蛋白的小鼠模型。尽管这些模型有助于理解病理过程，但在识别有效药物方面不太成功，部分原因在于小鼠和人类生理学差异，尤其是红系生成和红细胞方面。因此，利用人类红细胞开发SCD模型以补充小鼠研究的兴趣日益增加。
**当前人类SCD模型**
**使用患者来源材料的细胞模型**：患者来源红细胞（RBCs）是研究HbS聚合生物物理后果最直接的离体系统。目前体外无法稳健生成完全成熟、脱核的红细胞，因此来自SCD患者的新鲜红细胞为镰变、阳离子转运、流变学、膜脆性、与内皮细胞粘附以及对成熟红细胞特异表现的药物筛选提供了不可替代的平台。经典研究利用患者红细胞确立了HbS聚合、膜损伤和异常粘附之间的联系，该方法目前在治疗筛选和机制研究中仍广泛使用。然而，这些模型固有地受限于供体间差异、需要重复采集样本，以及无法模拟红系分化或进行遗传操作以探究因果机制。因此，患者RBCs能准确反映终末期细胞病理，但对这些异常如何在红系生成中产生提供的见解有限。患者来源的细胞系统是当前模拟SCD红系生成最具生理相关性的平台，因为它们捕获了SCD的内在异质性，包括许多修饰基因的影响。此外，由于直接来源于SCD患者，这些细胞可能保留慢性炎症、治疗暴露和骨髓应激的特征，而这些均深刻影响红系分化和红细胞功能。其中，从SCD患者分离的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）为探究该疾病的发育和分子起源提供了强有力的切入点。从外周血分离的CD34+细胞（通常可从换血产物中获取，不增加患者负担）可在体外分化为红系谱系，从而能够在患者特异性遗传背景下研究红系分化、氧化应激、炎症预激和珠蛋白基因调控。重要的是，SCD HSPC来源的红系母细胞重现了病理性红系生成的多个标志，包括终末分化延迟和无效、凋亡增加、氧化和蛋白毒性应激增强、珠蛋白合成失调以及异常炎症预激。这些表型反映了SCD患者骨髓中观察到的应激性红系生成状态，并提供了理解HbS聚合和炎症信号如何协同损害红细胞生成的机制框架。此外，由于这些培养保留了患者特异性遗传背景，它们捕获了HbF水平、应激反应和无效红系生成易感性方面的临床相关个体间差异。原代HSPCs是基因编辑从概念策略成功转化为临床批准SCD疗法的核心。患者来源的CD34+ HSPCs忠实地重现了最终重建患者造血系统的细胞染色质景观、DNA修复途径和谱系定向程序。因此，它们提供了唯一可靠的平台，用于严格优化和验证基因编辑方法（如CRISPR-Cas9介导的BCL11A增强子破坏）的效率、精确性和持久性。自体SCD HSPCs的离体编辑使得在移植前直接测量靶向编辑、脱靶风险、克隆适应性和红系分化能力成为可能，从而促进安全临床转化。这些系统还揭示了编辑后的干细胞如何维持长期重建能力，同时产生具有稳定胎儿血红蛋白诱导或校正珠蛋白表达的红系母细胞，为患者持久治疗获益提供了机制基础。因此，原代HSPC平台不仅仅是实验工具，更是使基因治疗从概念验证走向变革性的一次性治疗的不可或缺的桥梁。如上所述，患者来源HSPC系统的一大优势在于其适合遗传和药理学操作，尤其是在促进胎儿血红蛋白合成方面。慢病毒敲低、CRISPR基因编辑和小分子调节可在红系分化的特定阶段应用，从而能够直接因果测试HbS聚合、氧化应激途径、炎症小体激活和应激红系生成的候选调节因子。这使得可以超越患者样本中的相关性观察，在全人类、疾病相关背景下建立分子途径与下游红系表型之间的机制联系。SCD中的慢性炎症和细胞应激远超成熟RBCs，深刻重塑HSPC区室，改变谱系定向、增殖能力和对治疗操作的响应性。通过将SCD HSPCs的单细胞转录组学与慢病毒基因治疗试验的临床数据相结合，研究表明最原始的干细胞和祖细胞区室在离体处理之前就已被预编程为增强的炎症和干扰素信号以及偏向髓系谱系定向。这些内在改变与移植后植入受损和基因校正细胞贡献减少相关，从而在干细胞水平上将SCD相关炎症与治疗疗效的可变性联系起来。该研究证明SCD骨髓环境将持久的分子程序印记到HSPCs上，确立了造血干细胞功能障碍是SCD病理生理学的重要组成部分，并强调了原代HSPC模型对于理解疾病生物学和先进治疗反应不可或缺。尽管如此，基于HSPC的系统也有显著限制，包括增殖能力有限、获取骨髓来源细胞受限、以及显著的供体间差异（不同遗传背景导致的疾病严重程度修饰因子，包括但不限于γ-珠蛋白水平修饰因子）。此外，使用基因编辑细胞的实验通常在含有未编辑和异质编辑细胞的混合群体中进行，因为无法分离和培养具有所需编辑的纯细胞群体，这使数据解释复杂化并导致实验间变异性。最后，分化方案仅能生成至网织红细胞阶段，且实验室间缺乏标准化进一步限制了跨研究可比性。尽管存在这些挑战，患者来源HSPCs提供了分子扰动与疾病相关红系生物学之间的宝贵桥梁，使其成为SCD机制和转化研究不可或缺的工具。
**诱导多能干细胞**：诱导多能干细胞（iPSCs）通过过表达转录因子从患者体细胞组织生成，刺激去分化至多能性。在诱导造血分化后，iPSCs可提供近乎无限的HSPC来源，且具有来源个体大致完整的遗传背景，尽管表观基因组受组织来源和重编程过程本身的影响。虽然多项研究已成功从SCD个体生成iPSCs，但该疾病的全面表型建模受几个因素阻碍，最显著的是iPSC来源红系细胞主要表达胚胎/胎儿珠蛋白模式，排除了βS聚合和缺氧下镰变诱导。其他挑战包括通常需要复杂的多阶段培养系统进行iPSC造血和红系分化，加上方案和iPSC系性能之间的变异性，阻碍了可重复性。此外，不完全的红系成熟仍是iPSC培养全面疾病建模的障碍，有限的脱核限制了网织红细胞的产生，阻碍了其在SCD研究中的应用。尽管有研究报道iPSC来源βS/βS红系细胞中一些脱核现象，但高HbF水平排除了缺氧下细胞镰变或毛细血管流下层粘连蛋白粘附。另一项研究报道iPSC红系培养中6%-10%脱核，但这些网织红细胞未进行镰变或流动粘附测定。由于无法重现SCD的主要病理特征，SCD iPSCs的应用转而集中于基因校正策略，包括使用工程化锌指核酸酶或CRISPR-Cas9基因编辑。近期一些研究展示了从SCD iPSC来源红系细胞诱导有限HbS产生的成功。有研究通过RP-HPLC报道红系细胞中βS-珠蛋白占总珠蛋白的2%，并展示了CRISPR-Cas9介导的基因校正至野生型β-珠蛋白。另一项研究通过HPLC检测到可检测的HbS水平，并通过电子显微镜观察到部分缺氧诱导的HbS聚合。虽然这代表了未来的希望，但目前iPSC来源SCD红系细胞中HbS产生水平不足以反映患者情况，阻碍了表型疾病表现，进而否定了其在药物筛选和机制研究中的应用。此外，在考虑iPSC模型进行基因编辑研究时，应考虑到核型异常的报道。然而，iPSC培养系统的持续改进在提高红系母细胞脱核率和成人珠蛋白产生方面显示出前景，表明iPSCs在未来SCD建模中可能发挥更突出的作用。
**永生化细胞系**：永生化红系祖细胞系，最著名的是脐带血来源的HUDEP-2和成人骨髓来源的BEL-A，已成为离体提供可持续红系细胞供应的宝贵工具。这些细胞系使研究人员能够克服原代培养的供体间差异和有限可扩展性，同时提供成人珠蛋白表达谱和相比iPSC来源红系细胞改善的红系分化，以及更短更简单的培养方案。永生化红系系的另一个优势在于其易于进行精确基因组操作，使其非常适合研究机制问题和评估基因校正或基因调节策略。此外，修饰后的细胞系可以冻存，为下游应用提供可持续供应。在近期研究中，HUDEP-2和BEL-A均被用作创始人系，通过CRISPR-Cas9基因编辑引入纯合E6V镰状细胞贫血（SCA）突变来生成SCD模型系统。有研究成功生成了镰状HUDEP-2（sHUDEP-2）细胞系，其分化培养产生的晚期红系细胞（主要为晚幼红细胞）显示稳健的HbS产生和>40%的形态学镰变。作者进一步证明了慢病毒βT87Q-珠蛋白添加的剂量依赖性抗镰变活性，展示了该技术在评估SCD治疗策略中的实用性。同样，sHUDEP-2系已被用于证明通过编码Cas9、指导RNA和供体DNA的全合一非整合慢病毒系统对内源性βS-珠蛋白基因中SCA突变进行一次性校正，实现了高达42%的蛋白质水平校正。然而，使用sHUDEP-2研究SCD中无效红系生成的结果与原发性SCA红系细胞培养中观察到的结果形成对比——虽然原代细胞来源的SCA红系母细胞在分化过程中表现出升高的ROS和显著降低的GATA1蛋白，但在sHUDEP-2细胞系培养中未观察到这一点。这表明SCD患者病理性骨髓微环境的继发效应可能是SCD中无效红系生成的主要驱动因素，而非源于红系内在特性。2025年，有研究报道生成了具有验证的HbS产生和确认的镰变表型（在有核晚幼红细胞和网织红细胞中）的SCA BEL-A系。该系还表现出响应γ-珠蛋白产生增加而镰变活性降低，与已知的HbF抗镰变效应一致。虽然在SCA BEL-A系中观察到一定程度的无效红系生成（通过流式细胞术分析证明），但与原代SCA细胞培养相比减少。细胞系建模SCD方法提供了几个优势，包括提供遗传可追踪且易于修饰的平台，以研究单个蛋白质在镰变调节和下游事件中的作用。此外，短分化方案允许筛选需要在红系发育期间暴露细胞才能观察到潜在抗镰变效应的小分子（例如通过细胞蛋白质组改变），而非仅应用于SCD个体来源的成熟RBCs。未来与缺氧活细胞成像和分析流程的整合将能够高通量筛选此类候选药物，包括监测整个分化过程中的表型变化。与原代细胞培养一样，细胞系来源红系细胞的一个限制是它们无法从网织红细胞成熟为红细胞阶段（至少在目前方案下）。虽然细胞系研究已清楚证明网织红细胞（甚至核晚幼红细胞）能够镰变，但与成熟RBCs相比，生物物理和细胞骨架特性的差异导致镰变动力学改变、刚性增加和镰变逆转倾向降低。因此，在可能的情况下，将培养网织红细胞的任何发现用患者来源RBCs进行验证以评估可转移性非常重要。细胞系模型系统的另一个限制是与原代培养相比脱核效率欠佳。然而，至少在SCA BEL-A的情况下，通过过滤可以从相对较小的培养体积（约20 mL）中获得足够的网织红细胞以进行缺氧下的细胞镰变测定。由于基因编辑后γ-珠蛋白表达再激活在两种细胞系中均有可能，因此适当筛选亚克隆或长期培养中的细胞对研究人员也是重要的考虑因素，因为HbF增加具有表型修饰效应。此外，虽然BEL-A细胞系对羟基脲（HU）具有验证的增强HbF反应，但HUDEP-2的报道不一，一些课题组报告阳性HU反应，另一些报告无反应，在使用此类细胞系筛选γ-珠蛋白诱导化合物时应考虑这些发现。最后，重要的是考虑先前描述的HUDEP-2和BEL-A中的核型异常，以及任何潜在的克隆变异，特别是对于下游基因编辑应用（尽管值得注意的是没有报告含珠蛋白位点染色体的变化）。尽管存在这些因素，SCD细胞系模型系统为研究潜在疾病病理和测试新治疗方法提供了可持续、可扩展细胞系统中的有吸引力选项。
**人类SCD模型开发中**
**整合微流控共培养系统**：包含内皮细胞、免疫细胞和流动RBCs的微流控系统为模拟SCD特异性微血管病理提供了有力工具。这些平台能够可控地重现微血管剪切应力、缺氧-复氧循环和炎症激活，允许在生理相关流动条件下实时可视化HbS聚合、红细胞镰变、与内皮粘附以及闭塞事件。内皮和免疫区室的整合进一步允许研究白细胞、血小板和炎症细胞因子如何放大血管闭塞和血管损伤，这是SCD病理生理学的核心特征。尽管有这些优势，微血管芯片系统目前仍主要局限于模拟循环中发生的事件。它们通常依赖于引入装置中的成熟RBCs或网织红细胞，因此不能捕获源自骨髓的红系分化、应激红系生成或无效成熟的上游过程。然而，微流控技术仍为SCD研究的未来带来巨大希望，超越其目前在血管闭塞建模中的应用。通过将受控流体流动与确定的氧梯度以及骨髓中存在的各种细胞类型（包括患者来源HSPCs）相结合，下一代微流控平台可被设计为模拟镰状红系生成发生的骨髓微环境的关键特征。此类系统将使得能够实时研究缺氧、炎症细胞因子和红系岛内细胞-细胞相互作用如何塑造红系分化、应激反应和HbS聚合。在SCD背景下，慢性炎症和低氧应激深刻改变造血干细胞功能和红系成熟，骨髓芯片模型可能为驱动无效红系生成和溶血的早期细胞事件提供前所未有的窗口。如果成功开发，这些平台将弥合红系培养与疾病体内方面之间的差距，在生理相关微环境中为机制研究和治疗筛选提供强大且可扩展的框架。
**类器官模型**：三维（3D）类器官和组织工程系统是疾病建模的新兴前沿，可能代表以更整合和生理相关方式建模SCD的有前景方法。通过将造血细胞与基质、内皮和免疫组分在仿生支架或水凝胶中结合，这些方法可以重现骨髓微环境或次级淋巴器官（如脾脏，镰状红细胞在其中被过滤和破坏）的方面。原则上，此类系统将允许同时模拟红系分化、炎症预激和促进SCD病理生理学的细胞-细胞相互作用。确实，骨髓微环境类器官模型发展的进展显示了这些前沿平台用于SCD建模的潜力。然而，基于类器官的SCD模型仍处于早期发展阶段。关键挑战包括控制细胞组成、实现可重复的红系成熟和脱核、维持长期培养稳定性，以及扩展这些系统用于机制研究或药物测试。虽然它们桥接红系生成、血管病理和免疫失调的潜力巨大，但在3D类器官平台可常规用于模拟SCD病理生理学或治疗反应之前，必须克服重大的技术和生物学障碍。
**评估离体细胞镰变的方法学**
开发成功诱导和量化红细胞及红系细胞（无论是离体产生的还是从SCD个体获得的）镰变程度的方法，对于这些细胞模型系统的表型读出至关重要，包括响应药物和基因编辑干预。本节总结了目前实现离体缺氧诱导镰变的方法，以及鉴定正常与镰状细胞的检测和量化方法。在镰变诱导方面，由于HbS纤维聚合是缺氧依赖性的，诱导细胞周围环境低氧是触发成核机制的关键。最具成本效益且技术难度最低的方法之一是使用焦亚硫酸钠，这是一种氧清除化合物，将氧气转化为硫酸根离子。因此该方法常用于即时护理筛查测试以诱导细胞脱氧和脱水。其他化学方法包括使用原儿茶酸和原儿茶酸3,4-双加氧酶，已被证明可在数秒至数小时内实现可重复的样品脱氧。然而，这些基于氧清除的缺氧诱导方法缺乏精细控制和适应性，例如允许暴露于多个脱氧和复氧循环。为解决这一问题，许多研究团队使用组成可控的气体室，通常与显微镜或其他技术耦合以实时评估镰变。聚合也可通过血红蛋白-一氧化碳复合物的光解离诱导，导致快速纤维形成。或者，细胞可以在缺氧下（使用手套箱或脱氧缓冲系统）甚至常氧下固定以显示不可逆镰状细胞，供后续分析。在镰状细胞检测和量化方法方面，光学显微镜是评估镰状细胞形态的常用方法，可在活细胞成像系统内动态进行或通过评估终点测定的固定细胞进行。活细胞成像系统允许在多孔板格式中连续成像数小时，然后从每个图像序列提取镰变谱以产生逐帧的正常和镰状细胞计数。通过这种方法，可对细胞施加多个氧合和脱氧循环以模拟循环环境。或者，可如前所述从固定细胞图像进行镰变量化。在任一情况下，可通过利用监督分类方法"训练"软件识别镰状细胞来实现自动化图像分析和量化。此外，通过扫描电子显微镜或X射线断层扫描可实现更高分辨率的细胞镰变可视化，能够详细表征抗镰变化合物对形态学的影响，尽管通量远低于其他方法。近年来，成像流式细胞术已成为检测镰状细胞的替代方法。成像流式细胞术在高通量能力方面优于显微镜技术，每秒可检测数千个细胞，而成像孔中的玻片仅能检测数百个细胞。然而，由于目前方法限于常氧下数据采集，需要细胞固定，因此无法对活细胞成像。此外，该技术的性质意味着无法随时间追踪单个细胞和直接评估镰变动力学。超越形态学分析，细胞变形性的改变提供了检测和量化镰状细胞的另一种潜在读出。Ektacytometry是一种常用的基于激光衍射的生物物理技术，用于测量RBC变形性，由于脱氧HbS聚合诱导的膜刚性增加，可区分正常和镰状RBCs。通过在变形性测量期间引入受控氧张力梯度，细胞可暴露于生理相关的氧合/脱氧循环，类似于活细胞成像方法。这种氧梯度ektacytometry方法已被用作评估抗镰变剂、评估不同SCD基因型之间细胞变形性差异以及评估不同治疗方案的平台。然而，近期一项研究发现氧梯度ektacytometry不能预测SCD儿童的血管闭塞发作，因此该方法的临床预测价值仍不确定。在考虑SCD药物筛选方法时，这些细胞测定的高通量兼容性对于实现大量候选药物的自动化成像和分析至关重要。虽然药物再利用文库筛选已使用固定细胞成像和384孔板中患者RBCs的活细胞成像得到证明，但未来测定可受益于与HSPC和永生化细胞系培养的整合，以筛选其功效需要暴露于分化中红系母细胞的化合物（正如生理情况那样）。此外，将高通量方法与微血管芯片模型或其他更复杂的多细胞系统相结合，将使药物筛选在更生理相关的系统中进行，有望提高临床转化潜力。
**未来展望**
本综述总结了目前可用的人类SCD红系模型，并强调了它们各自的优势和劣势，从RBCs到HSPC、iPSC和细胞系方法。这些相对简单的基于细胞的模型系统为人类特异性疾病建模提供了宝贵工具，并显示出未来整合到更复杂建模平台以研究SCD更系统方面的前景。虽然患者来源RBCs目前提供完全成熟红系细胞的唯一来源并因此具有独特优势，但能够离体重现红系成熟（包括来自HSPCs和红系细胞系）的红系模型允许研究SCD红系分化，进而可能实现更全面的疾病建模。确实，未来与炎症剂和巨噬细胞共培养系统的整合可能产生更具代表性的SCD模型系统，并揭示影响镰状骨髓微环境的生理相关因素。例如，提高对SCD中炎症预激机制的理解可能为解决SCD患者中观察到的高植入排斥率提供新方法，这是基因治疗方法中一致结果需要克服的关键障碍。关于晚幼红细胞能够缺氧诱导镰变的观察提出了这些镰状红系母细胞在红系岛和更广泛骨髓微环境中潜在影响的问题。离体重建中央巨噬细胞和发育中红系母细胞提供了一种可能的方法来研究这些相互作用及其对SCD中失调骨髓微环境的潜在影响，允许探究SCD中巨噬细胞-红系串扰。除了SS基因型，对SCD家族中其他基因型的建模将是探究疾病分子机制和治疗反应异同的关键。在较少研究的HbSC疾病中，为何HbS在仅含约50% HbS的红细胞中聚合仍未明确确立。此外，HbSC患者的临床特征在很大程度上无法解释，包括脾肿大和视网膜病变发生率增加。将HbSC患者来源细胞或细胞系与微血管建模相结合可能为这些临床观察提供机制解释，进而为对抗性治疗策略提供信息。源自BEL-A和HUDEP-2的SCD模型系具有统一遗传背景的优势，能够实现可重复性和分析特定于SS突变的效果。这种一致性还允许药物评估而不受患者特异性遗传差异的混杂变异影响。此外，这些模型提供了引入和研究候选疾病修饰变异的受控平台。然而，由于SCD疾病严重程度受不同遗传背景调节，直接创建来自患者HSPCs的细胞系将很有价值，例如代表主要βS单倍型：塞内加尔、班图（或中非共和国）、贝宁和阿拉伯-印度，这些单倍型严重程度部分因HbF水平遗传修饰因子而异，以及HbSC、HbSD、HbS/β地中海贫血变异和HbS/α地中海贫血性状变异。这样的目录将能够在不同基因型间进行更广泛的治疗效度验证，帮助确定候选治疗是广泛有效还是最适合特定患者亚群。目前可用的细胞镰变测定方法提供了一系列互补方法，可用于评估基因编辑或药物干预在SCD模型系统中的治疗影响。在确定哪种方法最适合特定研究时，应考虑每种方法的优势和限制平衡，例如在受控缺氧下活细胞成像评估镰变动力学的能力与使用固定样品时更详细的结构评估之间权衡。超越全细胞镰变测定方法，直接评估HbS聚合的生物物理研究也发挥重要作用，特别是在确定具有直接抗镰变效应化合物的机制基础时。无论如何，需要进一步开发基于可访问平台的标准化和可重复方法，以便SCD研究社区能够容易采用。
**结论**
人类SCD红系模型系统为研究疾病分子机制和筛选新治疗策略提供了宝贵平台。每种方法提供不同优势，包括完全成熟红系细胞动力学（患者RBCs）、从来源于SCD环境的祖细胞重现红系生成的能力（患者HSPCs），以及易于遗传操作和可持续供应（红系细胞系）。将这些模型与其他细胞类型和/或3D支架整合带来增加复杂性的潜力，从而增加离体重现人类疾病表型的准确性。最终，此类模型为在SCD研究中朝着替代、减少和优化动物模型使用的重要步骤提供了支撑。
