Cd8a基因敲除对肠道菌群与肝脏代谢的影响研究

《Immunity, Inflammation and Disease》：Effects of Cd8a Gene Knockout on Gut Microbiota and Liver Metabolism

　　

目的：评估由Cd8a基因敲除导致的CD8+T细胞缺陷对肠道菌群和肝脏代谢的影响，并初步探索其潜在机制。方法：研究人员通过敲除小鼠Cd8a基因构建CD8+T细胞缺陷小鼠模型，采用聚合酶链式反应（PCR）和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。将小鼠分为三组：正常对照组、CD8+T细胞缺陷组和CD8+T细胞回输组，每组6只。通过磁珠分选从正常对照小鼠中分离CD8+T细胞，经尾静脉注射回输至CD8+T细胞缺陷小鼠体内，每3天回输一次，共4次。末次回输后4周收集粪便样本，提取DNA进行16S rRNA基因测序分析；同时收集小鼠肝脏，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析。结果：研究人员发现，CD8+T细胞缺陷引起的肠道菌群改变主要影响厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）。CD8+T细胞缺失后，Catabacter、Vicinamibacter、Mesorhizobium、Catellatospora和Stomatobaculum等细菌的丰度增加（p < 0.05）；回输CD8+T细胞后，这些细菌的丰度呈下降趋势（p < 0.05）。研究人员还鉴定了小鼠肝脏中与CD8+T细胞状态显著相关的5条主要代谢通路。结论：CD8+T细胞对肝脏代谢反应和肠道微生物群落多样性具有显著影响。

研究背景与科学问题

CD8⁺T细胞是适应性免疫应答的核心组分，在清除胞内感染和肿瘤细胞中发挥关键作用。肠道黏膜作为机体防御的第一道屏障，含有大量免疫细胞，其中CD8⁺T细胞通过分泌多种因子和发挥细胞毒性效应维持肠道屏障功能。肝脏作为人体最大的消化器官，通过胆道向肠道分泌胆汁酸，进而影响肠道菌群，促进有益菌生长并抑制有害菌。门静脉系统将肠道中的营养物质和毒素运输至肝脏处理，同时肝脏通过胆道系统将胆汁酸排入肠道，与微生物共同代谢，形成肝脏与肠道之间的相互调控关系，即肠肝轴（gut-liver axis）。然而，在严重联合免疫缺陷病（SCID）、HBV/HCV/HIV等慢性病毒感染以及放化疗后，人体内T细胞水平会显著降低。尽管已知肠道菌群失衡可导致胆碱缺乏、肠道通透性增加、短链脂肪酸合成减少及胆汁酸组成改变，从而引发肝脏炎症、纤维化和代谢紊乱，但CD8⁺T细胞缺陷对肠道菌群多样性、肝脏生化代谢及其关联性的影响尚不清楚。因此，本研究旨在探索CD8⁺T细胞缺陷引发的肠道菌群和肝脏代谢变化，阐明免疫系统（CD8⁺T细胞）与肠肝轴之间的联系。

研究方法概述

研究人员采用雌性C57BL/6J小鼠和C57BL/6J-Cd8aem1cyagen基因敲除小鼠（购自赛业生物科技有限公司）作为实验动物，所有小鼠均在SPF级动物设施中饲养。实验设置三组：正常对照组（C组）、CD8⁺T细胞缺陷组（CH组）和CD8⁺T细胞回输组（ZG组），每组6只。关键技术方法包括：采用聚合酶链式反应（PCR）和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定；通过磁珠分选从正常小鼠脾脏中分离CD8⁺T细胞，经尾静脉注射回输至缺陷小鼠体内，每3天回输一次共4次；采用流式细胞术检测CD8⁺T细胞比例；对粪便样本进行16S rRNA基因测序分析肠道菌群多样性；采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对肝脏样本进行非靶向代谢组学分析；利用QIIME2软件评估Alpha多样性指数，基于Bray-Curtis算法进行Beta多样性分析，并通过LEfSe分析和Metastats软件筛选差异菌群；采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行代谢物多元统计分析。

研究结果

动物模型构建： 流式细胞术结果显示，正常C57BL/6J小鼠中CD8⁺T细胞比例为41.9%，而缺陷小鼠仅为0.99%。定量回输CD8⁺T细胞后第1天，比例恢复至16.4%，第3天显著降至0.86%，差异具有统计学意义。因此，研究人员采用每3天重复回输的策略以维持小鼠体内CD8⁺T细胞水平的稳定。PCR基因型鉴定确认了纯合子缺陷小鼠（436 bp条带）和野生型个体（578 bp条带）。

肠道菌群多样性分析： 在OTU水平上的韦恩分析显示，三组共获得5337个OTU，其中对照组2263个，缺陷组2310个，回输组2096个。稀释曲线和等级丰度曲线表明测序结果可靠。Alpha多样性分析显示，各组Good's Coverage值均为1，满足测序深度要求。与缺陷组相比，回输组的Simpson指数和Shannon指数均降低（p < 0.05），表明回输CD8⁺T细胞后小鼠肠道菌群的物种多样性下降。PCoA主坐标分析和NMDS分析结果表明，正常对照组与CD8⁺T细胞缺陷组的微生物群落结构存在显著差异。

肠道菌群丰度分析： 在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌门；在科水平上，Muribaculaceae和毛螺菌科（Lachnospiraceae）为优势菌科；在属水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group和未分类的Muribaculaceae为优势菌属。

LEfSe分析： 以LDA阈值≥3.5为标准，共识别出24种独特细菌物种。不同组间细菌物种的变异主要存在于厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）中。

差异肠道菌群分析： 在科水平上，与正常对照组相比，缺陷组中unclassified_Clostridia_UCG_014、unclassified_RF39、uncultured_Lachnospiraceae_bacterium、uncultured_Erysipelotrichaceae_bacterium和bacterium_endosymbiont_of_Onthophagus_Taurus呈上升趋势（p < 0.05）；回输组中这些菌群呈下降趋势（p < 0.05）。在属水平上，与正常对照组相比，缺陷组中unclassified_Clostridia_UCG_014、Intestinimonas、unclassified_RF39、uncultured_Lachnospiraceae_bacterium、uncultured_Muribaculaceae_bacterium、Family_XIII_AD3011_group、uncultured_Erysipelotrichaceae_bacterium、Catabacter、Vicinamibacter、Mesorhizobium、unclassified_bacterium_endosymbiont_of_Onthophagus_Taurus、Catellatospora和Stomatobaculum呈上升趋势（p < 0.05）；回输组中这些菌群呈下降趋势（p < 0.05）。

肝脏差异代谢物筛选： 基于VIP > 1、p < 0.05和|log2FC| > 2的条件，缺陷组与对照组相比共筛选出121种代谢分子，其中64种上调、57种下调；回输组与对照组相比共筛选出123种代谢分子，其中48种上调、75种下调。

代谢物多变量统计分析： PCA散点图和OPLS-DA分析显示，对照组与缺陷组之间、缺陷组与回输组之间存在明显的分离，表明CD8⁺T细胞缺失及后续回输诱导了小鼠肝脏代谢反应的显著改变。

差异代谢物层次聚类分析： 与正常对照组相比，缺陷组中3alpha,7alpha,12alpha-三羟基-5beta-胆甾烷、1-(6Z,9Z,12Z-十八碳三烯酰基)-甘油-3-磷酸、Cer(d20:1/20:3(5Z,8Z,11Z)-O(14R,15S))、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、4-羟基壬烯醛和7-羟基十八烷酸表达升高，而4-甲基-2-氧代戊酸表达降低。其中7-羟基十八烷酸与α-亚麻酸代谢相关，1-(6Z,9Z,12Z-十八碳三烯酰基)-甘油-3-磷酸是花生四烯酸合成的前体，4-羟基壬烯醛是花生四烯酸代谢的特征终产物，7-脱氮-2'-脱氧鸟苷由Catellatospora合成。与正常对照组相比，回输组中熊去氧胆酸、Oblonglide、(+)-Vulgraon B和1,8-十七碳二烯-4,6-二炔-3,10-二醇表达降低，而Ferene triazine、Dapdiamide C、3'-羟基-HT2毒素、ADP-d-核糖和Daprodustat表达升高。

差异代谢物KEGG富集分析： 缺陷组与对照组相比，差异代谢分子涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、α-亚麻酸代谢、鞘脂代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解、类固醇生物合成、花生四烯酸代谢、初级胆汁酸合成和细胞色素P450对外源物质代谢等通路，其中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成与CD8⁺T细胞缺陷显著相关。回输组与对照组相比，差异代谢分子涉及α-亚麻酸代谢、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、初级胆汁酸生物合成、脂肪酸生物合成和嘌呤代谢等通路。

菌群-代谢物关联分析： 在属水平上，与对照组相比，缺陷组肠道中unclassified_Clostridia_UCG_014、Intestinimonas、uncultured_Lachnospiraceae_bacterium和Family_XIII_AD3011_group的相对丰度显著升高（p < 0.05），肝脏中PE(P-18:0/PGF1alpha)、2,3-双-O-(香叶基香叶基)-sn-甘油-1-磷酸-l-丝氨酸、Capsianoside II、Naftidrofuryl和6-[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-氨基嘌呤-9-基)-3,4-二羟基氧杂环戊烷-2-基]氧杂环己烷-2,5-二酮水平上调，而trans-2-十二碳烯酰肉碱、Vinfosiltine、CDP-DG(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/PGF1alpha)和庚-2,5-二烯酰肉碱水平下调。值得注意的是，Family_XIII_AD3011_group与trans-2-十二碳烯酰肉碱和庚-2,5-二烯酰肉碱呈显著负相关。

讨论与结论

讨论部分指出，CD8⁺T细胞在免疫系统中发挥关键作用，肠道菌群失调与多种免疫细胞密切相关。本研究发现，将CD8⁺T细胞过继转移至缺陷小鼠后，肠道菌群Alpha多样性降低，物种丰度下降，Beta多样性分析显示正常对照组与缺陷组的整体微生物群落结构存在显著差异，表明某些细菌类群在缺乏CD8⁺T细胞介导的免疫监视时发生失控增殖，而这种失调可通过过继转移恢复CD8⁺T细胞群得到逆转。Intestinimonas作为一种益生菌，可将膳食果糖和赖氨酸转化为丁酸盐，其在CD8⁺T细胞缺陷时可能通过丁酸盐维持肠道菌群多样性和稳态。整合分析发现，trans-2-十二碳烯酰肉碱和庚-2,5-二烯酰肉碱与Family_XIII_AD3011_group丰度呈显著负相关，这两种代谢物是线粒体β-氧化的中间产物，其丰度降低提示CD8⁺T细胞缺陷后肝脏线粒体脂肪酸氧化通量下降。此外，CD8⁺T细胞缺陷显著扰乱了支链氨基酸代谢通路，特别是4-甲基-2-氧代戊酸（亮氨酸的降解产物）在缺陷组中表达水平显著降低，表明支链氨基酸处于高表达状态，这可能通过mTOR信号通路影响CD8⁺T细胞的功能和发育。研究人员也指出了研究的局限性，包括采用系统性Cd8a基因敲除模型无法归因于特定CD8⁺T细胞亚群、未表征组织驻留记忆CD8⁺T细胞的比例、外源性转移的CD8⁺T细胞在体内持久性有限需反复补充等。

结论： CD8⁺T细胞对肝脏代谢反应和肠道微生物群落多样性具有显著影响。