## 中文标题 衰老成纤维细胞通过细胞间接触损害B细胞增殖（Senescent Fibroblasts Impair B Cell Proliferation via Cell–Cell Contact）

《Aging Cell》：Senescent Fibroblasts Impair B Cell Proliferation via Cell–Cell Contact

　　

衰老深刻损害疫苗效力，使老年人尽管接种疫苗仍高度易感传染病。尽管B细胞在老年人中保留了产生生发中心（GC）反应的内在能力，但T细胞、树突状细胞和滤泡树突状细胞（FDCs）的年龄相关缺陷限制了高亲和力、类别转换抗体反应的发展。在此，研究人员假设衰老成纤维细胞干扰B细胞活化和扩增，从而促成衰老过程中体液反应的减弱。为验证该假设，研究人员建立了体外系统，将表达CD40L的人扁桃体来源YK6成纤维细胞与外周血单个核细胞（PBMC）来源的B细胞共培养。在与对照或博来霉素处理的YK6成纤维细胞共培养条件下，测定了B细胞在低刺激和高刺激条件下的活化、增殖及表型。对照YK6成纤维细胞在二维（2D）和三维（3D）培养中均促进B细胞活化和增殖，而博来霉素处理的成纤维细胞则强烈抑制B细胞增殖，但不损害早期活化。来自博来霉素处理成纤维细胞的条件培养基（CM）部分减少B细胞增殖，但其程度低于直接共培养，表明细胞间接触是抑制B细胞增殖的关键因素。博来霉素处理的YK6成纤维细胞上调与淋巴细胞反应受损相关的基因，如PDCD1LG2，该基因可能影响B细胞活化。实际上，与博来霉素处理成纤维细胞共培养的B细胞未能完全启动糖酵解，且基本无法合成新蛋白质。综上所述，这些发现提示成纤维细胞中衰老样变化可能限制B细胞增殖能力，这可能促成衰老过程中B细胞反应的受损。

## 论文解读

### 一、研究背景与目的

疫苗接种是预防感染性疾病的有效公共卫生措施，通过产生病原体特异性抗体来限制（再）感染。然而，老年人群是当前疫苗策略覆盖不足的高风险群体，其感染发病率和死亡率均显著升高。衰老是有效疫苗免疫的主要障碍，对老年人造成双重影响：他们不仅感染后病情更重，而且对现有疫苗（包括新型mRNA疫苗）的保护性反应也较弱。保护性高亲和力类别转换抗体由浆细胞分泌，浆细胞源自称为生发中心（GC）反应的特化免疫过程。GC反应逐步进行：B细胞在GC形成前通过CD40-CD40L相互作用与T细胞互作；随后分化为GC T细胞和B细胞并进入B细胞滤泡形成GC。滤泡树突状细胞（FDCs）是一种特化的成纤维细胞，协调GC内T细胞和B细胞的运动定位，并作为抗原库支持持续的GC反应。已有研究表明，老年B细胞在很大程度上仍能参与GC反应，而T细胞和微环境（包括FDCs）的缺陷共同导致衰老中GC反应的减弱。研究人员前期通过异时异种共生实验证明，年龄相关的微环境缺陷是衰老中体液反应减弱的主要驱动力。衰老损害FDC的活化和扩增，尽管淋巴结内存在年轻的T和B细胞，GC形成仍减少。此外，衰老还损害FDC功能，包括趋化因子CXCL13表达受损及黏附分子和Fc/补体受体表达异常。值得注意的是，老龄小鼠淋巴样成纤维细胞中p21表达升高，提示淋巴样成纤维细胞在衰老过程中可能进入衰老状态。然而，衰老中FDC功能障碍的驱动因素尚未明确。本研究旨在探讨衰老成纤维细胞是否直接损害B细胞反应，从而为衰老相关体液免疫缺陷提供机制解释。

### 二、研究结论

研究人员建立了体外模型，将博来霉素诱导衰老的人扁桃体来源YK6成纤维细胞与PBMC来源的初始富集B细胞共培养，系统评估了衰老成纤维细胞对B细胞活化、增殖及代谢重编程的影响。研究发现，对照YK6成纤维细胞能在二维和三维培养中促进B细胞活化和增殖；而博来霉素处理导致的衰老成纤维细胞则几乎完全消除B细胞增殖能力，尽管B细胞仍表现出活化表型（CD69和ICAM-1表达）。条件培养基实验表明，分泌因子仅部分抑制B细胞增殖，远不如直接共培养的抑制效果，证实细胞间接触是主要的抑制机制。转录组分析揭示，博来霉素处理的YK6成纤维细胞上调多种B细胞抑制性配体，包括PDCD1LG2（PD-L2）、CD274（PD-L1）、TNFRSF14（HVEM）和ICAM1，同时下调B细胞支持分子CD40L、BAFF和CD73。代谢分析显示，与衰老成纤维细胞共培养的B细胞虽被活化，但未能充分上调葡萄糖转运蛋白GLUT1，且蛋白质合成能力严重受损，无法完成活化驱动的糖酵解重编程。该研究揭示了一种先前未被认识的机制——成纤维细胞衰老可直接损害B细胞增殖能力而不阻碍其早期活化，为理解衰老相关的体液免疫缺陷提供了新的视角。这些发现提示，淋巴微环境中成纤维细胞内在的衰老相关变化可能直接损害GC反应，是衰老过程中体液免疫受损的重要促成因素。

### 三、关键技术与方法

该研究采用了多项关键技术。研究人员使用了人扁桃体来源的永生化成纤维细胞系YK6（通过过表达TERT、TP53和CDK4并工程化表达CD40L和BAFF），以博来霉素（一种DNA损伤剂）处理5天诱导细胞衰老。外周血单个核细胞（PBMC）来自英国NHSBT-NCI服务提供的单个匿名人类供体白细胞锥。B细胞通过磁珠分选获得初始富集B细胞，以CellTrace Violet（CTV）标记后，在低刺激（抗IgM、CpG和可溶性CD40L）和高刺激（额外添加IL-2、IL-4和IL-6）条件下进行二维（2D）或三维（3D，Matrigel）共培养。流式细胞术用于检测B细胞活化（CD69、ICAM-1）、增殖（CTV稀释）、代谢标志物（GLUT1、CD98）及蛋白质合成（嘌呤霉素掺入）；SCENITH分析用于测定糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）依赖性；衰老相关β-半乳糖苷酶染色、γ-H2AX和Ki67染色表征衰老表型；bulk RNA测序及基因集富集分析（GSEA）鉴定差异表达基因和通路；定量RT-PCR验证衰老相关基因（CDKN1A、CDKN2A、IL6）表达；ELISA检测BAFF分泌水平。

### 四、研究结果

**2.1 成纤维细胞在体外促进B细胞活化和增殖。** 研究人员首先建立了体外B细胞刺激模型，在无刺激条件下B细胞不增殖；低刺激和高刺激条件下B细胞于第3天开始分裂，高刺激条件下增殖更快。将B细胞与YK6成纤维细胞共培养发现，仅在有成纤维细胞存在而无额外刺激时即可诱导B细胞增殖和活化（CD69和ICAM-1上调）。在3D条件下，共培养进一步增强低刺激和高刺激下的B细胞增殖和ICAM-1表达，表明淋巴样成纤维细胞在体外能支持B细胞反应。

**2.2 博来霉素处理的成纤维细胞抑制B细胞增殖，但不抑制活化。** 博来霉素处理5天诱导YK6成纤维细胞衰老，表现为衰老相关β-半乳糖苷酶阳性、细胞增大和颗粒性增加、Ki67阳性增殖细胞减少、IL6和CDKN1A表达上调。RNA测序证实细胞周期通路（E2F靶点、G2M检查点、有丝分裂纺锤体）显著下调，而SenMayo衰老基因集和免疫炎症通路上调。与衰老成纤维细胞共培养的B细胞，在低刺激和高刺激条件下增殖几乎完全消除，但CD69和ICAM-1表达的活化标记未受显著影响。在细胞分裂前的48小时时间点，对照组和衰老组B细胞活化水平相似，证明衰老成纤维细胞特异性抑制B细胞增殖而非活化。

**2.3 衰老成纤维细胞通过分泌蛋白和细胞表面表达蛋白抑制B细胞增殖。** 排除衰老旁观者效应后，研究人员收集博来霉素处理的YK6成纤维细胞条件培养基（CM）并用于刺激B细胞。衰老细胞CM导致B细胞增殖略微但显著下降（通常落后一个分裂峰），其抑制程度远小于直接共培养的完全消除效果，表明细胞表面蛋白是损害B细胞增殖的主要因素，分泌因子贡献较小。

**2.4 博来霉素处理的YK6成纤维细胞上调B细胞抑制性配体。** 博来霉素处理降低YK6细胞中CD40L和BAFF（小鼠CD8α标记）的表达及BAFF分泌。转录组分析发现，B细胞相互作用相关基因中ICAM1、CD274（PD-L1）、CD74、TNFRSF14（HVEM）和PDCD1LG2（PD-L2）表达升高，NT5E（CD73）轻微降低。流式细胞术证实ICAM-1蛋白水平（gMFI）上调而CD73表达降低。这些表面分子的变化可能通过细胞间接触直接抑制B细胞增殖。

**2.5 与衰老YK6细胞共培养限制B细胞代谢重编程。** 与对照成纤维细胞共培养的B细胞显著上调GLUT1和CD98表达；而与衰老成纤维细胞共培养的B细胞GLUT1上调受损，CD98上调比例相似。嘌呤霉素掺入实验显示，与衰老成纤维细胞共培养的活化（MHCIIhiCD69+）未分裂B细胞蛋白质合成显著降低。SCENITH分析揭示，无论与对照还是衰老成纤维细胞共培养，活化B细胞几乎完全依赖糖酵解而非OXPHOS，但与衰老细胞共培养时所有代谢条件下的嘌呤霉素掺入均显著降低，表明B细胞陷入“激活失败”状态——虽表达活化标志但代谢重编程不完全、蛋白质合成能力受损。

### 五、讨论与结论总结

本研究揭示了成纤维细胞衰老对B细胞增殖的直接影响。研究结果表明，衰老成纤维细胞通过细胞间接触机制损害B细胞增殖，而不损害早期活化，这种“活化但无法增殖”的状态与慢性淋巴细胞白血病中B细胞对PMA刺激无反应的失败钙信号现象具有相似性。博来霉素处理上调了多种B细胞抑制性配体（PD-L1、PD-L2、HVEM、ICAM-1），其中ICAM-1在T细胞上的高表达已被证明可损害B细胞活化和免疫球蛋白类别转换，提示衰老成纤维细胞可能通过高表达ICAM-1将B细胞“锚定”在细胞表面，增加其暴露于PD-L2和/或CD73等负调控因子的机会。值得注意的是，YK6细胞与人B区网状细胞相似但缺乏典型FDC标志物（CR1、FcγRIIB等），因此研究结果需谨慎解读。然而，老龄小鼠边缘网状细胞（MRCs）富集SenMayo衰老基因集且Il6、Cdkn1a和Igfbp7等衰老相关基因上调，与博来霉素处理的YK6细胞部分相似，支持该模型与体内衰老的相关性。该研究建立了一种体外系统，证明衰老成纤维细胞直接损害人B细胞增殖能力，为年龄相关体液免疫缺陷提供了潜在机制。确切的分子机制仍有待阐明，未来对衰老免疫微环境的单细胞水平分析将有助于进一步揭示这些现象。