基于二代测序技术鉴定中国非视网膜发育性眼病患者的遗传病因

《HUMAN MUTATION》：Next-Generation Sequencing to Identify Genetic Causes of Chinese Patients Affected With Non-retinal Developmental Eye Disorders

摘要专业翻译 为探究14个中国不同家系中非视网膜发育性眼病的遗传病因，研究人员对受试者进行了特异性遗传性眼病富集panel（HEDEP）或全外显子测序（WES）。研究人员进一步通过Sanger测序验证了致病性变异，并对可获得的家系成员进行了共分离分析。研究人员根据美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）和分子病理学协会（AMP）变异解读指南对序列变异进行了分类。研究人员分析了14例具有不同临床诊断的先证者，包括小眼球（伴或不伴小角膜和先天性白内障或先天性角膜混浊（CCO），4例）、眼前节发育不良（ASD，6例）——包括彼得异常（PA，1例）、PA合并小眼球（1例）、虹膜缺损或无虹膜（伴小角膜和/或先天性白内障，2例）、原发性先天性青光眼（PCG，2例）——先天性白内障（伴CCO或小角膜，3例），以及鲁宾斯坦–泰比综合征（RSTS，1例）。初始遗传模式分别为常染色体隐性（1例）、常染色体显性（5例）和散发性（8例）。研究人员在16个基因中鉴定出17个（可能）致病性变异和1个意义不明确的变异（VUS），包括BMP4、BCOR、PITX3和PAX6。其中8个为新变异，2个为de novo变异。研究人员利用in vitro剪接实验证实了PAX6内含子突变的致病性，并将意义不明确的变异的致病性重新定义为可能致病。发育性眼病患者的眼部及全身表型通常复杂，可能导致严重的视力损害和高致盲率。明确遗传病因有助于早期诊断及有效的治疗和康复策略，从而为这些患者的遗传及临床咨询提供有价值的见解。

论文解读文章

一、研究背景与意义

发育性眼病涵盖角膜、晶状体、虹膜和视裂等眼部结构的先天性缺陷，出生时即已存在，由正常眼发育过程中的异常所致。发育性眼病谱系广泛，包括小眼球、无眼球和眼缺损（MAC）；眼前节发育不良（ASD），涵盖原发性先天性青光眼（PCG）、无虹膜、虹膜角膜角发育不良和Axenfeld–Rieger异常；伴小角膜的先天性白内障；Leber先天性黑矇（LCA）；玻璃体视网膜发育不良；视神经疾病以及婴儿期眼球震颤等。发育性眼病可为单侧或双侧，常导致严重视力损害。已有超过200个与非视网膜发育性眼病相关的基因被报道。既往研究显示，MAC这一最严重的发育性眼病类型的出生患病率为每10万活产婴儿11.9例；PCG约影响每2万名儿童中的1例；先天性白内障在英国影响15岁以下儿童中每1万人中的3例。尽管这些发育性疾病罕见，但它们在全世界失明原因中占据显著比例。

尽管中国眼科医生在视网膜相关发育性眼病的遗传诊断方面取得了显著进展，但中国患者中非视网膜发育性眼病的遗传基础仍报道不足。该人群非视网膜发育性眼病的分子诊断尤为困难，原因包括：a）由于经济限制，获得医疗建议和基因检测的机会有限；b）高度异质性的临床表现和多样化的遗传病因导致诊断复杂，且许多发育性眼病作为涉及代谢、发育、躯体或感觉异常的综合征的一部分出现。

研究人员在既往研究中聚焦于遗传性视网膜疾病的基因诊断，证实了二代测序（NGS）技术结合全外显子测序（WES）或特异性遗传性眼病富集panel（HEDEP）可高效检测遗传性视网膜营养不良（IRDs）的遗传病因。本研究旨在报告14个中国非视网膜发育性眼病家系的临床和遗传发现，患者表现出复杂的眼部表型，伴或不伴全身表现。

二、研究设计与技术方法

研究人员从北京大学第三医院眼科招募了14个来自无亲缘关系的中国汉族家系的非视网膜发育性眼病先证者。所有患者均接受了标准眼科检查，包括最佳矫正视力（BCVA）、裂隙灯生物显微镜检查、眼压（IOP）测量、散瞳间接检眼镜检查和眼底照相，并在基因检测前接受系统性体格检查。研究人员根据Stone等人的标准并作小幅修改对遗传模式进行分类。研究人员采集了所有先证者及可用家系成员的血样并提取基因组DNA（gDNA），使用基于外显子捕获技术的HEDEP捕获靶基因的蛋白质编码区，该HEDEP可捕获483个遗传性眼病基因；或使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行WES，并在Illumina HiSeq X平台上进行NGS。研究人员按照ACMG/AMP指南对序列变异进行分类，使用PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster进行功能预测，并通过Sanger测序验证所有可能致病的变异及其与疾病表型的共分离情况。此外，研究人员进行了跨物种保守性分析、蛋白质三维结构建模和蛋白稳定性预测，并通过免疫荧光（IF）、蛋白质印迹（WB）、in vitro剪接实验和minigene构建等实验手段验证变异的致病性。

三、研究结果

3.1 中国非视网膜发育性眼病患者的临床表型

本队列共招募了来自14个无亲缘关系中国家庭的6名男性和8名女性先证者，所有患者均具有复杂、重叠的眼部表现。其中4例诊断为小眼球（伴或不伴小角膜、先天性白内障或CCO）；6例为ASD，包括2例PA（伴或不伴小眼球）先证者、2例先天性虹膜缺损或无虹膜（伴小角膜和/或先天性白内障）患者和2例PCG患者；此外还有3例先天性白内障（伴CCO或小角膜）患者和1例RSTS患者。所有先证者均在出生时或儿童期患有发育性眼病。根据临床数据，1例、5例和8例的遗传模式最初分别被分类为AR、AD和散发性。

3.2 中国非视网膜发育性眼病患者的分子诊断

在8例散发性病例中，研究人员在6例先证者中鉴定出BMP4（F01）、PITX3（F04）、CRYBB1和GCNT2（F06同时携带）、EPHA2（F07）、CRYGC（F10）和CREBBP（F12）的杂合突变，其遗传模式被重新定义为AD。2例PCG先证者（F13和F14）携带CYP1B1复合杂合变异，遗传模式被重新定义为AR。5个初始定义为AD的家系被确定携带BCOR（F02）、PITX3（F03）、CRYAA和PIKFYVE（F05同时携带）、MIP（F09）和PAX6（F11）基因的（可能）致病性变异，F02的遗传模式被重新定义为X连锁显性（XL），其余为AD。F08家系的先证者携带NHS基因的半合子致病性变异，遗传模式被重新定义为XL。本研究共在16个不同基因中鉴定出9个错义变异、5个移码变异、3个无义变异和1个内含子变异。根据ACMG/AMP指南，11个变异被定义为可能致病，6个为致病，1个为VUS，其中8个变异为本研究首次报道。

3.3 若干代表性病例

F01家系先证者为4岁女性，诊断为小眼球伴小角膜和CCO，携带BMP4杂合变异c.592C>T（p. Arg198?），遗传自其父亲，父亲虽携带该变异但无发育性眼病，仅患有近视。F02家系先证者为3岁女性，诊断为小眼球、先天性白内障和小角膜及眼球震颤，携带BCOR杂合变异c.1615C>T（p. Gln539?），该变异为本研究首次报道，其母亲携带相同变异并患有先天性白内障。F03家系先证者为3岁男性，患有PA和小眼球，携带PITX3杂合变异c.640_656dup（p. Gly220Profs?95），遗传自其父亲，家系中多个成员具有相似症状并携带相同变异。F04家系先证者为3岁女性，患有PA，携带PITX3的de novo杂合变异c.640_656del17bp（p. Ala214Argfs?42）。F11家系先证者为33岁女性，诊断为无虹膜、小角膜和先天性白内障，患者及其患病兄长携带PAX6杂合内含子变异c.141+4A>T，遗传自其母亲。通过in vitro剪接实验和minigene实验证实该内含子变异破坏了PAX6的剪接功能，导致假外显子（PE）纳入和外显子5跳跃两种异常产物。F12家系先证者为7岁女性，具有CCO、先天性青光眼、视盘发育不良、先天性玻璃体异常、发育迟缓、认知障碍、脑电图异常和自闭症等复杂临床表现，同时具有宽拇指和持续性胎儿指垫，携带CREBBP致病性杂合变异c.4244A>C（p. Gln1415Pro），其父母均未受影响，最终确诊为RSTS。F13家系先证者为6个月大女性，患有PCG，携带CYP1B1复合杂合变异c.872A>G（p. Asp291Gly）和c.319C>G（p. Leu107Val），分别遗传自其母亲和父亲。F14家系先证者为4岁女性，诊断为PCG，携带CYP1B1致病性复合杂合变异c.517G>A（p. Glu173Lys）和c.266T>C（p. Leu89Pro）。

3.4 两例VUS致病性的重新定义

F07家系先证者为31岁男性，诊断为先天性白内障和小角膜，携带EPHA2杂合变异c.584G>A（p. Arg195His），遗传自其无症状母亲。该变异为本研究首次报道，跨物种序列比对显示该位点高度保守。三维结构建模显示突变破坏了主链氢键并改变了表面静电势，多种软件预测蛋白稳定性下降。pSPL3 minigene实验未显示异常剪接产物，但免疫荧光和WB实验证实突变蛋白在细胞内的积累显著减少，蛋白稳定性下降。根据ACMG指南将该证据分类为PS3，最终将该变异从VUS重新分类为可能致病。F10家系先证者为63岁男性，诊断为先天性白内障、小角膜和虹膜缺损，携带CRYGC杂合变异c.121G>A（p. Gly41Ser）。三维结构分析显示该变异可能不影响主链结构，但多种软件预测其影响蛋白稳定性。免疫荧光实验显示突变蛋白倾向形成细胞内聚集体，并与p62（聚集体标志物）共定位；WB实验证实突变蛋白在上清液中的表达显著减少。根据ACMG指南将该证据分类为PS3，最终将该变异从VUS重新分类为可能致病。

四、讨论与结论

本研究招募了14例来自不同家系的发育性眼病患者，包括小眼球、ASD、先天性白内障和RSTS等。这些患者自童年起即具有复杂的眼部表型和较差的视力，尽管接受了多次眼科手术，预后仍较差甚至失明。研究在16个不同基因中鉴定出17个（可能）致病性变异和1个VUS，其中8个为新变异，2个为de novo变异，并通过in vitro剪接实验证实了PAX6内含子突变的致病性。

本研究报告了4例由不同基因变异导致的小眼球及相关异常病例。F01家系中BMP4无义突变Arg198?首次在表型正常的父亲中发现，支持BMP4无义突变具有可变表达性/不完全外显率。F02家系首次报道了BCOR基因新型杂合无义变异导致非系统性小眼球、小角膜和先天性白内障的女性患者，扩展了BCOR基因的表型谱。F03家系是首次报道PITX3杂合突变c.640_656dup（p. Gly220Profs?95）以显性模式导致PA和小眼球的严重表型。F04家系证实PITX3变异c.640_656del（p. Ala214Argfs?42）也可在显性模式下导致PA。此外，研究报道了PITX3和CREBBP的de novo致病性变异，强调了基因检测在识别这些家系遗传病因中的重要性。

本研究通过二代测序技术结合HEDEP或WES，有效鉴定了中国非视网膜发育性眼病患者的遗传病因，扩展了相关基因的突变谱和表型谱，并通过功能实验重新定义了VUS的致病性。明确遗传病因有助于早期诊断及有效的治疗和康复策略，为这些患者的遗传及临床咨询提供了有价值的见解。未来研究应进一步扩展发育性眼病的遗传和表型谱，探索罕见变异在疾病进展中的作用，深入研究种系嵌合体机制及其对遗传的影响，并通过纵向研究和整合基因组数据与临床发现，推进个体化医疗方法，改善受影响个体的诊断、治疗和遗传咨询。