食源性矢车菊素糖苷通过调控PI3K/Akt/GSK3β信号通路在AlCl3诱导的阿尔茨海默病样斑马鱼模型中发挥神经保护作用：C3R表现出最强总体疗效

《Food Science & Nutrition》：Neuroprotective Effects of Food-Derived Cyanidin Glycosides in an Alzheimer's Disease-Like Zebrafish Model Through Modulation of PI3K/Akt/GSK3β Signaling

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，缺乏有效且安全的干预措施。食物来源的花色苷（anthocyanins）因其神经保护潜力而日益受到关注；然而，单个矢车菊素糖苷（cyanidin glycosides）的具体机制仍未被充分理解。值得注意的是，结构不同的矢车菊素糖苷之间的比较疗效和机制差异尚未在体内（in vivo）进行系统评估。在本研究中，研究人员使用氯化铝（aluminum chloride, AlCl₃）诱导的AD样病理斑马鱼模型评估了三种矢车菊素糖苷：矢车菊素-3-O-芸香糖苷（cyanidin-3-O-rutinoside, C3R）、矢车菊素-3-O-槐糖苷（cyanidin-3-O-sophoroside, C3S）和矢车菊素-3-O-木糖苷（cyanidin-3-O-xyloside, C3X）。结果表明，这些化合物改善了认知表现和焦虑样行为，同时减轻氧化应激（oxidative stress）和神经炎症（neuroinflammation）并恢复胆碱能功能（cholinergic function），这由生化和免疫荧光分析所证实。此外，神经元损伤和Tau在Ser³⁹⁶位点的磷酸化被显著减轻。在受试化合物中，C3R在多个指标中一致表现出最显著的作用。在机制上，三种矢车菊素糖苷调节PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶，phosphatidylinositol 3-kinase）/Akt（蛋白激酶B，protein kinase B）/GSK3β（糖原合成酶激酶-3β，glycogen synthase kinase-3β）信号传导，表现为p-PI3K (Tyr⁴⁵⁸)/PI3K和p-Akt (Ser⁴⁷³)/Akt总体增加，以及p-GSK3β (Tyr²¹⁶)/GSK3β和p-Tau (Ser³⁹⁶)/Tau降低。LY294002（PI3K抑制剂）减弱了该通路相关的保护作用，支持PI3K/Akt信号传导的参与。总之，这些发现证明了与调节PI3K/Akt/GSK3β信号传导相关的神经保护作用，其中C3R表现出最强的总体疗效。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种以隐匿起病和逐渐认知衰退为特征的进行性神经退行性疾病，其临床表现包括记忆障碍、失语、失用、失认、视空间功能障碍和执行功能缺陷，常伴随行为和人格改变。随着预期寿命增加，AD的发病率和患病率在全球持续上升，已成为老年人主要死亡原因之一。据Alzheimer's Disease International（ADI）统计，全球约每3 s出现一例AD痴呆新发病例，且到2050年痴呆患者人数预计将超过1.52亿。这一快速增长的疾病负担给患者、家庭和医疗系统带来巨大压力。天然产物持续为药物发现和开发提供重要的生物活性化合物来源，用于AD治疗的几种乙酰胆碱酯酶抑制剂（acetylcholinesterase inhibitors, AChEIs），如加兰他敏（galantamine）和石杉碱甲（huperzine A），来源于植物，说明天然化合物作为神经保护剂来源的潜力。在食源性植物化学物中，矢车菊素（cyanidin）是一种广泛分布的花色苷元，主要以糖基化形式存在于深色植物性食品中，包括黑米、黑豆和紫甘薯。矢车菊素糖苷常通过水果、蔬菜、豆类和红葡萄酒摄入，支持其作为膳食生物活性化合物的相关性。越来越多证据表明，矢车菊素及其衍生物在多种神经系统疾病中发挥保护作用，包括AD、帕金森病和胶质母细胞瘤。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside, C3G）是研究最广泛和最丰富的矢车菊素糖苷之一，已有报道其口服给药后可穿过血脑屏障并在脑组织中蓄积，发挥神经保护作用。研究人员前期筛选评估了五种矢车菊素衍生物，包括cyanidin-3-O-(trans-p-coumaroyl)-diglycoside（C3GG）、C3R、cyanidin-3-O-arabinoside（C3A）、C3S和C3X，其中C3R、C3S和C3X显示出最有前景的活性，因此被选作进一步研究。这些化合物分别含有不同的芸香糖苷、槐糖苷和木糖苷取代。然而，大多数既往研究集中于单个矢车菊素化合物，对结构不同的矢车菊素糖苷的直接体内评价仍有限，尤其是不同糖基化模式是否影响神经保护活性以及胆碱能功能和PI3K/Akt/GSK3β信号传导的调节，尚未被系统研究。PI3K/Akt信号通路在调节神经元存活、分化和凋亡中起关键作用。PI3K激活促进Akt磷酸化，从而支持神经元存活并限制凋亡。活化的Akt进一步调节下游靶点，包括GSK3β，而AD相关病理中PI3K/Akt信号受损可能导致对GSK3β的抑制不足。作为下游丝氨酸/苏氨酸激酶，过度活化的GSK3β促进Tau过度磷酸化和神经元凋亡。因此，PI3K/Akt/GSK3β通路被认为是AD的潜在治疗靶点。包括红景天苷（salidroside）、牛蒡子苷元（arctigenin）和积雪草酸（asiatic acid）在内的几种天然化合物已有报道通过与调节PI3K/Akt/GSK3β信号传导相关而发挥神经保护作用。这些观察为研究矢车菊素糖苷的神经保护作用是否与该通路相关以及其不同糖部分是否导致不同通路反应提供了生物学依据。斑马鱼（Danio rerio）被广泛用作补充性脊椎动物模型，可桥接体外实验与哺乳动物研究。斑马鱼行为学试验能够稳健且可量化地评估感觉运动、情绪、学习和记忆功能，便于快速筛选用于神经系统疾病的生物活性化合物。此外，斑马鱼具有特征明确的DA能、胆碱能和NA能神经递质系统，并已被广泛用于研究神经退行性疾病和中枢神经系统机制。特别是，AlCl₃暴露在斑马鱼中产生部分AD样表型，包括认知障碍、氧化应激和胆碱能功能障碍，使该模型适合对食源性神经保护化合物进行初步体内评价。在本研究中，研究人员在具有AlCl₃诱导AD样病理的成年斑马鱼中，对C3R、C3S和C3X进行了等剂量比较。行为学测试与组织学、超微结构、生化、免疫荧光、基因表达和蛋白磷酸化分析相结合，以评估认知表现、神经元完整性、胆碱能功能、氧化和炎症反应、Tau磷酸化以及PI3K/Akt/GSK3β信号传导。随后使用PI3K抑制剂LY294002检验该通路的功能参与。本研究旨在阐明结构不同的矢车菊素糖苷的差异神经保护特征，并为优先选择有前景的食源性候选物以进行进一步药代动力学和转化评价提供基础。研究人员采用成年野生型斑马鱼（AB strain），样本来源于Hubei Chuangxin Biotechnology Co. Ltd.（Wuhan, China），并经动物伦理批准（Approval No. 2025-37）。以AlCl₃诱导AD样模型：水体100 μg/L暴露4 d，第4天腹腔注射AlCl₃ 4.2 mg/mL、10 μL/fish；设Control、Model、Dpz 2 mg/kg、C3R/C3S/C3X 2 mg/kg组，灌胃5 d。另设LY294002通路验证。行为学采用NOR、NTT和T-maze；检测AChE、ACh、ChAT、SOD、GSH、MDA；qRT-PCR分析mRNA；H&E/Nissl、TEM、Western blot、免疫荧光；并对PI3Kα（PDB ID: 4JPS）和AKT1（PDB ID: 3CQU）进行分子对接。统计用mean±SEM、one-way ANOVA和Tukey检验，p<0.05为显著。研究结果显示，3.1 矢车菊素糖苷改善AlCl₃诱导斑马鱼的学习和记忆缺陷：通过新颖物体识别试验（novel object recognition test, NOR），模型组对熟悉物体（familiar object, FO）偏好增加、对新物体（novel object, NO）探索时间减少；C3R、C3S、C3X和多奈哌齐（donepezil, Dpz）增加NO探索时间并恢复NO偏好；总移动距离和平均速度无显著差异。3.2 矢车菊素糖苷减轻AlCl₃诱导斑马鱼的焦虑样行为：通过新缸试验（novel tank test, NTT），模型组总移动距离、平均速度和进入顶部区域频率降低，进入顶部区域潜伏期延长和底部区域偏好增加；C3R和C3X缩短进入顶部区域潜伏期并增强上部探索活动。3.3 矢车菊素糖苷改善T迷宫试验中的学习和记忆缺陷：通过T迷宫，模型组进入绿色室潜伏期延长且绿色室偏好降低；C3R、C3S、C3X和Dpz减少进入绿色室潜伏期，并增加在绿色室累计时间；运动参数无显著改变。3.4 矢车菊素糖苷减轻AlCl₃诱导斑马鱼的胆碱能功能障碍和氧化应激：生化分析显示模型组乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性增加，乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）含量和胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）活性降低；C3R、C3S、C3X和Dpz部分逆转这些改变；模型组丙二醛（malondialdehyde, MDA）升高、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量降低，治疗组恢复抗氧化能力。3.5 矢车菊素糖苷减轻AlCl₃诱导斑马鱼的神经元损伤：通过苏木精-伊红（hematoxylin–eosin, H&E）染色和尼氏（Nissl）染色，模型组细胞排列松散、神经元密度降低、血管充血、Nissl小体减少；C3R、C3S、C3X和Dpz增加细胞密度、减轻组织损伤并增加Nissl小体。3.6 矢车菊素糖苷保护AlCl₃诱导斑马鱼的神经元超微结构：通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM），模型组出现膜完整性破坏、胞质空泡化、细胞水肿、线粒体肿胀和可识别细胞器减少；Dpz、C3S或C3X部分改善，C3R组膜边界更完整、胞质空泡化更少、线粒体和其他细胞器保留更好。3.7 矢车菊素糖苷调控AlCl₃诱导斑马鱼的mRNA表达：通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR），模型组ache和aplp2上调，chata、bdnf和ntrk2b下调，il6、il1b、tnfa和rela上调，pik3r1和akt2下调，gsk3ba上调；C3R、C3S、C3X和Dpz降低促炎基因表达，并使pik3r1、akt2和gsk3ba表达向正常水平恢复。3.8 矢车菊素糖苷调节AlCl₃诱导AD样斑马鱼模型中的PI3K/Akt/GSK3β信号传导：通过Western blot，模型组AChE表达增加、ChAT表达降低，p-Tau (Ser³⁹⁶)表达增加，p-PI3K (Tyr⁴⁵⁸)/PI3K和p-Akt (Ser⁴⁷³)/Akt比值降低，p-GSK3β (Tyr²¹⁶)/GSK3β比值增加；C3R、C3X和Dpz显著逆转这些改变，C3S显著增加p-PI3K (Tyr⁴⁵⁸)并降低p-GSK3β (Tyr²¹⁶)，但未显著恢复p-Akt (Ser⁴⁷³)。LY294002预处理减弱C3R、C3S和C3X诱导的ChAT、p-PI3K和p-Akt增加，同时增加AChE、p-GSK3β和p-Tau (Ser³⁹⁶)表达；总PI3K、Akt或GSK3β水平无显著变化。分子对接显示C3R对PI3Kα和AKT1的预测对接分数最有利。3.9 免疫荧光揭示矢车菊素糖苷恢复胆碱能标志物：免疫荧光染色显示模型组AChE荧光强度增加、ChAT表达降低；Dpz、C3R、C3S和C3X逆转这些改变，其中C3R效果相对更强，AChE水平接近正常且ChAT表达显著恢复。讨论部分指出，AD致病机制复杂且尚未完全理解，涉及胆碱能功能障碍、Tau过度磷酸化、氧化应激和神经炎症；膳食多酚包括花色苷因潜在神经保护作用受到关注。研究人员前期比较筛选五种矢车菊素衍生物，确定C3R、C3S和C3X为最有前景候选物，但其神经保护机制尚不清楚。本研究使用体内斑马鱼模型结合行为、生化、组织学和分子分析，比较评价三种矢车菊素糖苷对AD样病理的保护作用并探索相关机制。短期AlCl₃诱导斑马鱼模型捕捉了部分AD样表型，包括Tau Ser³⁹⁶磷酸化增加、氧化应激、胆碱能功能障碍和炎症反应。组织学和超微结构分析显示治疗保护神经元完整性。铝可穿过血脑屏障并在海马蓄积，促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、损害抗氧化防御并激活炎症介质。C3R、C3S和C3X恢复抗氧化能力并减少脂质过氧化；氧化应激与胆碱能功能障碍密切相关。Dpz作为AChE抑制剂也改善氧化应激和炎症指标；既往研究显示胆碱酯酶抑制剂可通过烟碱型乙酰胆碱受体，尤其α7nAChR激活PI3K/Akt信号，因此Dpz的广泛作用可能源于增强胆碱能信号的下游反应，而非直接调控每个测量靶点。机制方面，氧化应激可损害PI3K/Akt信号并促进GSK3β异常激活，导致Tau过度磷酸化和神经元功能障碍；AlCl₃暴露降低PI3K p85 Tyr⁴⁵⁸和Akt Ser⁴⁷³磷酸化，增加GSK3β Tyr²¹⁶和Tau Ser³⁹⁶磷酸化；C3R和C3X一致逆转这些改变，而C3S呈部分通路反应。GSK3β受位点特异性磷酸化差异调节：Ser9磷酸化为抑制性，Tyr216磷酸化与激酶活性增加相关；由于Akt经典上通过Ser9而非Tyr216调控GSK3β，且未直接测定GSK3β激酶活性，观察到的改变应解释为协同的通路相关调节，而不是直接Akt介导的GSK3β Tyr216磷酸化。LY294002减弱保护作用进一步支持PI3K/Akt信号的功能参与。分子对接提示C3R的α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucose单元和鼠李糖6-脱氧甲基可能允许构象适应，涉及极性和疏水接触；C3S的β-(1→2)-连接二葡萄糖苷部分和C3X的单木糖苷部分产生不同位阻和预测相互作用模式；但分子对接提供的是结构假设，而非直接结合或功能激活证据，也不能完全解释C3R更强的总体生物功效。从食品科学角度看，本研究确定C3R在相同剂量条件下是三种矢车菊素糖苷中最一致有效的化合物，支持进一步研究；短期AlCl₃斑马鱼模型提供快速体内筛选平台，但不复制人类AD慢性、年龄依赖性发展，也不能排除一般抗氧化或铝相互作用的影响；灌胃不充分反映复杂食品基质中的长期膳食摄入，物种差异限制斑马鱼药代动力学直接外推至哺乳动物；胃肠道稳定性、生物利用度、代谢和脑暴露仍需确定；LY294002实验支持PI3K/Akt/GSK3β信号参与，但未识别直接分子靶点；化合物撤除后行为改善的持久性未评估，未来研究将包括更长治疗期和治疗后随访，并使用APP/PS1小鼠等哺乳动物AD模型评价药代动力学、血脑屏障穿透和直接靶点。研究结论翻译：总之，三种矢车菊素糖苷对斑马鱼AD样病理具有保护作用，其中C3R表现出最强的总体疗效。这些发现提供了初步的体内证据，表明其神经保护作用与氧化应激和胆碱能功能的改善以及PI3K/Akt/GSK3β信号传导的调节相关。在确定C3R的膳食或功能食品潜力之前，仍需进一步的哺乳动物药代动力学和功效研究。