异常骨髓造血与造血干细胞龛重塑以性别依赖性方式先于癌症恶病质发生

《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Aberrant Myelopoiesis and Haematopoietic Stem Cell Niche Remodelling Precedes Cancer Cachexia Onset in a Sex-Dependent Manner

　　

**背景：** 男性癌症患者发生恶病质的可能性比女性高出30%；然而，其潜在病因仍未知。骨髓造血（myelopoiesis）在癌症恶病质中诱导炎症，进而导致肌肉萎缩。癌症恶病质启动期间骨髓造血的差异是否导致恶病质发病率存在性别差异，目前仍不清楚。

**方法：** 雄性及雌性C57BL/6与B6(C)-Ccr2^tm1.1Cln/J小鼠被随机分为假手术组（PBS）或皮下接种路易斯肺癌细胞（Lewis lung carcinoma，LLC）以诱导恶病质。研究人员在接种后2周（14天）、2.5周（17天）及3.5周（24天）处死小鼠，评估身体成分、造血干细胞和祖细胞（haematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）、髓系免疫细胞迁移、骨髓龛细胞动力学及CCL2表达的变化。

**结果：** LLC接种使雄性小鼠在3.5周时肿瘤-free体重、瘦体重、腓肠肌-比目鱼肌质量及肌纤维横截面积（cross-sectional area，CSA）显著降低（p<0.05），而雌性小鼠维持了肿瘤-free体重、瘦体重及CSA。在骨髓中，雄性小鼠的造血干细胞（haematopoietic stem cells，HSCs）在2、2.5和3.5周时较假手术组增加，雌性小鼠则在2.5周时较2周和3.5周增加（p<0.05）。多能祖细胞（multipotent progenitors，MPPs）在雄性小鼠2、2.5和3.5周时较假手术组显著增加，雌性小鼠在2.5周时较假手术组、2周和3.5周显著增加（p<0.05）。下游的常见髓系祖细胞（common myeloid progenitors，CMPs）和粒细胞-单核细胞祖细胞（granulocyte-monocyte progenitors，GMPs）在雄性小鼠2.5周时升高，CCR2⁺GMPs在雄性小鼠2.5周和雌性小鼠3.5周达到峰值（p<0.05）。HSC龛组成的性别差异亦被观察到：雄性小鼠在2周时骨祖细胞、成骨细胞和内皮细胞增加，而雌性荷瘤小鼠在2.5周时骨祖细胞和内皮祖细胞增加（p<0.05）。血浆C-C基序趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）浓度随肿瘤进展在两性中均升高；然而，CCR2⁺祖细胞和巨噬细胞在2.5和3.5周时较2周减少（p<0.05）。在骨骼肌中，CCL2浓度在3.5周时升高，CCR2⁺/CD206^?巨噬细胞比例增加，而总巨噬细胞丰度不变（p<0.05）。巨噬细胞亚群与雄性而非雌性小鼠CSA下降相关。

**结论：** 该研究提示，异常骨髓造血和性别特异性HSC龛重塑先于雄性小鼠恶病质发展过程中的肌肉萎缩。这些发现为理解异常骨髓造血在癌症恶病质中的作用提供了重要的初步步骤，并将髓系偏移确立为潜在的治疗靶点。

**癌症恶病质中异常骨髓造血的性别依赖性作用：研究解读**

**一、研究背景与问题**

癌症恶病质（cancer cachexia）是肿瘤患者常见的进行性骨骼肌和脂肪丢失综合征，影响50%–80%的癌症患者，直接导致超过30%的癌症相关死亡。流行病学数据显示男性恶病质发病率约为女性的两倍，且男性患者肌肉力量下降与癌症相关疲劳存在相关性，而女性缺乏此关联。恶病质是一种以促炎细胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α和IFNγ）循环水平升高为特征的慢性炎症状态，但既往研究表明这些细胞因子在两性中的功能存在差异：IL-6过表达在女性中不诱发或加速恶病质，而与游离脂肪酸水平升高相关；男性中IL-6拮抗剂则可阻止恶病质进展。免疫细胞，尤其是髓系来源的先天免疫细胞，是炎症因子的主要生产者。恶病质患者循环中性粒细胞增多，表明白细胞介素-6等信号驱动髓系偏移（myeloid skewing）。尽管已知髓系细胞在恶病质骨骼肌中积累并诱导肌肉萎缩，巨噬细胞清除可恢复肌纤维横截面积（cross-sectional area, CSA），但免疫系统在恶病质性别差异中的精确作用仍不清楚。骨髓是髓系细胞的发源地，造血干细胞（haematopoietic stem cells, HSCs）分化产生多能祖细胞（multipotent progenitors, MPPs）、常见髓系祖细胞（common myeloid progenitors, CMPs）和粒细胞-单核细胞祖细胞（granulocyte-monocyte progenitors, GMPs），最终形成粒细胞和单核细胞。HSC龛（niche）包括成骨系、内皮和脂肪细胞，控制HSC命运。CCR2-CCL2轴介导造血细胞从骨髓迁移，恶病质肌肉中巨噬细胞、中性粒细胞和髓系来源抑制细胞含量升高。然而，异常骨髓造血对系统性炎症及癌症恶病质性別差异的贡献程度尚属未知。因此，该研究旨在确定雄性及雌性小鼠中异常骨髓造血、髓系细胞向骨骼肌募集与癌症恶病质发生之间的时间关系。

**二、研究内容与意义**

研究人员使用路易斯肺癌（Lewis lung carcinoma, LLC）皮下接种模型，在雄性及雌性C57BL/6和CCR2-GFP报告小鼠中诱导恶病质，在接种后2、2.5和3.5周三个时间点系统评估身体成分、骨髓造血干细胞及祖细胞（haematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）动态、HSC龛细胞组成、血浆和肌肉CCL2浓度以及骨骼肌免疫细胞浸润。结果发现雄性小鼠在3.5周时出现显著的肿瘤-free体重和瘦体重下降、腓肠肌-比目鱼肌质量减轻及肌纤维CSA缩小，而雌性小鼠维持体重和瘦体重稳定，尽管两性肿瘤生长相似。骨髓分析显示雄性小鼠HSCs和MPPs在2周即开始增加，CMPs和GMPs在2.5周升高，CCR2⁺GMPs在2.5周达到峰值；雌性小鼠则呈现时间点特异性的延迟扩张模式，HSCs和MPPs在2.5周才增加。HSC龛组成方面，雄性小鼠在2周时骨祖细胞、成骨细胞和内皮细胞增加，而雌性小鼠骨祖细胞和内皮祖细胞在2.5周升高。尽管两性血浆CCL2浓度均随肿瘤进展升高，但肿瘤内CCR2⁺造血细胞却随时间减少，提示骨髓来源细胞未在肿瘤中积累。骨骼肌中，两性CCL2浓度和CCR2⁺炎性巨噬细胞比例在恶病质发生前增加，但巨噬细胞亚群与CSA的关联呈性别依赖性：雄性小鼠CCR2⁺巨噬细胞与CSA呈负相关，而雌性无此关联。scRNA-seq分析（雄性小鼠）显示巨噬细胞在恶病质发生前上调萎缩相关配体（Il-1、Tgfb1、Tnfsf12、Tnf），肌核相应上调受体和萎缩基因（Trim63、Fbxo32）。这些发现表明异常骨髓造血和性别特异性HSC龛重塑是男性恶病质的早期事件，确立髓系偏移为潜在治疗靶点。

**三、主要技术方法**

该研究使用的关键技术方法包括：LLC皮下荷瘤小鼠模型（C57BL/6及CCR2-GFP转基因小鼠，雄性及雌性各时间点队列）、流式细胞术（多色抗体染色分析骨髓HSPCs及免疫细胞亚群）、EchoMRI身体成分分析、免疫荧光染色结合Fiji软件分析肌纤维CSA、CCL2酶联免疫吸附测定（ELISA）、单细胞RNA测序（scRNA-seq，二次分析雄性小鼠骨骼肌数据，使用Seurat和RStudio）、蛋白质免疫印迹（Western blot，检测SMAD3/P-SMAD3、SMAD7、TGFBR1）、以及microCT骨髓脂肪组织定量。所有统计学分析采用双因素方差分析（ANOVA）、Pearson相关分析和Fisher's R-to-Z转换，由盲法研究者执行。

**四、研究结果**

**3.1 LLC选择性诱导成年雄性而非雌性荷瘤小鼠恶病质。** 通过肿瘤生长监测、身体成分分析和骨骼肌形态评估发现，雄性小鼠在3.5周时肿瘤-free体重和瘦体重显著降低，肌纤维CSA在2.5和3.5周缩小，而雌性无显著变化，尽管两性肿瘤生长速度相似。

**3.2 造血作用的性别特异性改变先于恶病质。** 流式细胞术分析骨髓发现，雄性HSCs在2、2.5和3.5周均显著升高，CMPs和GMPs在2.5周升高，CCR2⁺GMPs在2.5周达到峰值；雌性HSCs、MPPs和MEPs仅在2.5周出现时间点特异性升高，CCR2⁺髓系祖细胞扩张延迟。这些数据表明雄性在恶病质前发生加速的髓系分化和迁移。

**3.3 恶病质发展过程中HSC龛细胞动力学的性别差异。** 分析骨髓龛细胞发现，雄性骨祖细胞和成骨细胞在2周升高，雌性骨祖细胞和内皮祖细胞在2.5周升高，雄性与雌性HSC龛重塑的时间差异与各自HSC扩张动力学相一致。

**3.4 恶病质发展减少骨髓来源免疫细胞向肿瘤的迁移。** 血浆CCL2浓度在2.5周和3.5周随肿瘤进展升高，但肿瘤内CCR2⁺HSPCs和巨噬细胞随时间减少，提示骨髓来源细胞未在肿瘤中积累。

**3.5 雄性小鼠恶病质发展过程中髓系细胞标志物和CCL2-CCR2信号标志物积累。** scRNA-seq二次分析确认肿瘤小鼠肌肉中中性粒细胞和单核细胞比例增加，Ccr2表达在单核细胞中于2.5周降低，Ccl2表达从2周的巨噬细胞驱动转变为3.5周多种免疫和非免疫细胞参与。

**3.6 恶病质发展促进骨骼肌内骨髓来源巨噬细胞积累并对肌纤维横截面积产生性别依赖性影响。** 肌肉CCL2浓度在3.5周两性均升高，CCR2⁺巨噬细胞比例增加，主要由炎性CCR2⁺CD206^?亚群驱动；相关性分析显示CCR2⁺巨噬细胞与CSA的关系在雄性和雌性间方向相反。

**3.7 巨噬细胞在恶病质发生前转录萎缩因子并伴随肌核转录变化。** scRNA-seq显示雄性小鼠巨噬细胞在2周和3.5周高表达Il-1、Tgfb1、Tnfsf12和Tnf，肌核上调相应受体及Foxo1、Smad3等信号因子，随后在3.5周表达Trim63和Fbxo32萎缩基因；然而肌肉匀浆中SMAD3、P-SMAD3、SMAD7和TGFBR1蛋白水平无变化。

**五、讨论与结论**

讨论部分总结了以下要点：异常骨髓造血已在多种疾病状态中被观察到，肿瘤来源因子可诱导癌症中的异常骨髓造血。免疫抑制性CCR2⁺单核细胞和巨噬细胞在免疫逃逸期浸润肿瘤，CCR2耗竭可抑制转移、提高生存率并预防癌症复发。该研究中雄性小鼠在恶病质发生前HSC扩张、CMPs和GMPs增加以及CCR2⁺GMPs扩增，提示雄性存在异常骨髓造血和CCR2⁺髓系祖细胞扩张；而雌性表现为时间点特异性重塑和延迟的CCR2⁺髓系祖细胞扩张，且未发生恶病质。由于肿瘤内髓系细胞未检测到性别差异且随肿瘤进展减少，持续的骨髓造血可能与其他晚期癌症系统性病理相关。HSC龛方面，雄性骨祖细胞增加时间早于雌性，与HSC扩张时间吻合，提示骨祖细胞支持HSC扩张；雌性延迟的骨祖细胞扩张和内皮祖细胞升高可能有利于HSC维持并延迟扩张。肌肉中CCR2⁺巨噬细胞比例增加而总巨噬细胞浓度不变，表明骨髓来源巨噬细胞成为肌肉巨噬细胞池的主要贡献者。性别差异方面，雄性肌肉富集CD206⁺“M2”巨噬细胞亚群，雌性肌肉富集CD206^?“M1”亚群，CCR2⁺巨噬细胞与CSA的相关性在性别间方向相反，提示特定巨噬细胞亚群在骨骼肌萎缩中可能发挥相反功能。scRNA-seq结果表明雄性肌肉驻留巨噬细胞在恶病质发生前即启动肌核萎缩信号，但其后Western blot未检测到蛋白水平变化，可能反映纤维类型特异性改变或转录后调控。该研究直接比较了雄性和雌性在多时间点的多项指标，为理解异常骨髓造血在癌症恶病质中的作用提供了重要第一步，并将髓系偏移确立为潜在治疗靶点。

研究结论：异常骨髓造血是癌症恶病质的早期事件，并非仅为支持肿瘤生长；雄性小鼠中性别特异性HSC龛重塑和早期异常骨髓造血先于恶病质发生；骨髓来源巨噬细胞积累发生在两性中，但巨噬细胞组成的差异可能是癌症恶病质发病率性别差异的基础。