犬瘟热病毒血凝素蛋白在 Expi293F 细胞系中的定点整合有助于在小鼠和犬中产生保护性中和抗体反应

《Methods》：Site-specific integration of canine distemper virus hemagglutinin protein in Expi293F cell lines contributes to protective neutralizing antibody responses in mice and dogs

　　

摘要

尽管减毒活疫苗（MLV）已在全球范围内广泛应用，犬瘟热病毒（CDV）仍然是高度易感的野生动物和家犬面临的重要威胁。因此，开发一种全新的完全安全的疫苗是必要的。本研究中，以CDV血凝素（H）蛋白作为抗原靶点，将其与信号肽及Twin Strep II或Fc标签融合后，在瞬时转染的Expi293F细胞中进行表达。与其他信号肽（TRY、AP、IL-2和INS）相比，HSA和小鼠Igκ信号肽显著产生了最多的CDV H蛋白分泌表达。Fc标签通过二聚体形成阻碍了CDV H蛋白的分泌。通过双重或单sgRNA引导的dCas9-piggyBac系统，结合潮霉素筛选，获得了在AAVS1安全港位点具有CDV H基因和GFP-T2A-BleoR基因位点特异性整合的Expi293F细胞池。与单sgRNA相比，双sgRNA策略提供了更高的转座效率，GFP⁺细胞比例分别为10.59%或10.32%。通过流式细胞术分选的两个单克隆Expi293F细胞株E6和G10，可在上清液中稳定生产2.8克/升的CDV H蛋白，纯度超过95%。分泌的CDV H蛋白在犬和狗中均可诱导强烈的剂量依赖性中和抗体反应。每千克2毫克的CDV H蛋白剂量可使犬在攻毒强毒株CDV HBF-1感染后实现100%存活。本研究建立了一种基于转座子的平台，用于在Expi293F细胞中稳定表达CDV H抗原蛋白，展现了该系统的极大可塑性，并为未来的亚单位疫苗开发提供了灵活多样的框架。

引言

CDV属于副黏液病毒科麻疹病毒属，是一种全球流行的病毒病原体，曾导致家犬和野生动物食肉动物发生的主要发病和死亡[1]。CDV减毒活疫苗（MLV）已被广泛应用于家犬和毛皮动物，过去几十年间发病率和死亡率已大幅下降[2]。然而，流行病学数据显示CDV仍呈全球性分布，对高度易感和濒危的野生动物种群及其保护构成巨大威胁[3]。1985年，CDV感染导致北美最后已知的野生黑足鼬（Mustela nigripes）种群数量灾难性下降，该流行病使剩余个体的死亡率达到100%，导致其在野外局部灭绝[4]。2003年，CDV在俄罗斯远东地区造成4只野生虎和1只远东豹（Panthera pardus orientalis）的致命感染[5]，[6]。2020年至2022年间，尼泊尔的疫情至少夺去了6只印度豹（P. pardus fusca）的生命[7]。这些有记载的案例证明，CDV在高易感野生动物中的病死率往往接近100%。CDV基因组为单链、负链、不分节段的RNA，从3′端到5′端编码六种结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大聚合酶蛋白（L）[8]。H蛋白和F蛋白是CDV病毒颗粒表面的两种主要包膜糖蛋白[9]。H蛋白与宿主细胞受体SLAM和Nectin-4结合，F蛋白通过构象变化触发膜融合过程以实现病毒入侵[10]。尽管H基因遗传变异性高，它已被广泛用于系统发育分析以及表征流行株间的遗传关系[11]。CDV的H蛋白是诱导中和抗体的主要抗原蛋白，在病毒复制和致病性中发挥关键作用[12]。因此，CDV H蛋白作为CDV血清学检测和新型疫苗开发的核心抗原靶点[13]。

信号肽通过经典的分泌途径介导新生多肽链跨越内质网（ER）膜转运进入ER腔。天然信号肽不一定是最有效的，这一观察结果促使我们鉴定高效的信号肽以融合到重组蛋白上，从而提高其分泌效率[14]。用更高效的替代信号序列替换天然信号肽可显著提高下游蛋白的分泌效率[15]。异源信号肽已被证明在原核和真核系统中具有功能互换性，甚至跨越不同物种边界[16]，[17]，[18]。因此，可利用异源信号肽在选定的宿主表达平台中驱动目标基因（GOI）的高保真分泌。

基因编辑技术能够实现精确高效的遗传操作。锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）实现了靶向基因组编辑，但其广泛应用受限于复杂的蛋白质工程。RNA引导的CRISPR/Cas9系统代表了第三代可编程核酸酶，大大增强了特异性靶向基因组位点的能力，可依据不同的编辑应用以实现不同效率的靶向基因敲除、序列插入和碱基编辑。piggyBac（PB）转座子系统已成为在多种真核物种（包括哺乳动物系统）中实现稳定外源基因整合的有力工具。利用piggyBac（PB）转座酶系统进行靶向整合的研究已得到广泛探索。虽然ZFP-PB系统可在ZFP结合位点实现靶向整合，但存在明显的脱靶活性[19]，[20]。Gal4-PB系统在Gal4位点显示24%的整合偏向性，但特异性不足[19]。TALE-PB在CCR5位点的效率极低，仅为0.01%至0.015%[21]。相比之下，CRISPR-Cas9通过sgRNA引导实现了精确靶向[22]，[23]。最初优化的dCas9-PB系统未能介导位点特异性整合[24]，即使Exc+Int?突变体也表现出有限效率[25]。值得注意的是，抗生素筛选可能高估整合效率并引入假阳性。采用双sgRNA策略，在0.32%的细胞中实现了位点特异性转座[26]，[27]。因此，开发具有显著改善靶向精度的转座子基础整合系统仍是该领域面临的重大挑战。

本研究综合前述发现，筛选了有前景的信号肽并评估了其在增强CDV H蛋白分泌产量方面的表现。通过将dCas9-piggyBac（dCas9-PB）介导的双sgRNA定向位点特异性基因组整合与优化信号肽筛选相结合，我们建立了两个稳定细胞株，实现了CDV H蛋白的高水平分泌表达。该蛋白在小鼠和犬中均能诱导出保护性的病毒特异性中和抗体。这些发现为生产高质量诊断试剂和亚单位疫苗提供了一种新颖理想的抗原表达策略。

章节摘要

细胞、病毒、质粒、抗体和动物

Expi293F细胞（Thermo，美国马萨诸塞州）在Expi293表达培养基（Thermo，美国马萨诸塞州）中培养，置于37℃、8% CO₂、120 rpm/min的加湿培养箱中。Vero细胞（CRL-1587，ATCC，美国）和犬源SLAM标记的Vero细胞（37）在Dulbecco改良伊氏培养基（DMEM）（Gibco，Invitrogen，美国）中培养，补充10%胎牛血清（Sino Biological，中国北京）、链霉素（0.1 mg/mL）和青霉素（100 U/mL）（TransGen，中国北京），在加湿条件下

Fc标签抑制CDV H蛋白的分泌表达

为研究Fc标签对CDV HBF株H蛋白胞外结构域表达的影响，我们构建了一个H蛋白的真核表达载体。如图1B所示，将四种不同的信号肽插入pFUSE-mIgG1-Fc1载体的AgeI和XhoI限制性酶切位点之间。随后，将CDV-HBF-H的胞外结构域克隆至XhoI和NcoI位点之间。由于Fc标签已存在于载体骨架中，因此所得

讨论

尽管家犬已广泛接种减毒活疫苗（MLVs），但仍有相当比例的未免疫食肉动物携带CDV抗体，表明其此前已暴露于CDV抗原。同时，CDV的隐性传播对高度易感的野生动物种群构成重大威胁[33]，[34]。作为CDV的主要包膜糖蛋白，H蛋白介导病毒入侵并诱导中和抗体反应，使其成为亚单位疫苗和血清学的关键靶点

CRediT作者贡献声明

Yu Wang（王雨）：调查研究、撰写初稿、软件、数据整理。Yingxin Bi（毕映心）：可视化、数据整理。Jiaxi Cai（蔡佳西）：验证。Shuren Fang（方树仁）：形式化分析。Xiaohan Fang（方晓涵）：验证。Xianghong Xue（薛香红）：撰写—审阅与编辑、项目管理、方法论、资金获取、概念构思。

资助

本研究得到吉林省发展和改革委员会项目（项目编号：2024C015-4）；国家科技重大专项—重大传染病防控项目（项目编号：2025ZD01900100）；以及国家自然科学基金委员会（项目编号：82072332）的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

王雨|毕映心|蔡佳西|方树仁|方晓涵|薛香红

中国农牧科学院特种动植物科学研究院动物病毒病基因工程疫苗研究室，中国长春