酸胁迫差异性影响非典型肠致病性大肠埃希菌（aEPEC）毒力相关表型

《Microbial Pathogenesis》：Acid Stress Differentially Affects Virulence-Associated Phenotypes in Atypical Enteropathogenic Escherichia coli

　　

摘要专业翻译 非典型肠致病性大肠埃希菌（atypical enteropathogenic Escherichia coli，aEPEC）是全球范围内日益重要的腹泻病原体，但对其在胃肠道酸性环境中存活能力及酸胁迫对毒力相关表型的影响尚缺乏系统研究。本研究选取13株分离自巴西圣保罗地区腹泻患儿的aEPEC菌株，评估其在模拟胃酸条件（pH 3.4和pH 2.6）下的存活能力，并进一步分析酸胁迫对生物膜形成、上皮细胞黏附与侵袭以及attaching-effacing（AE）损伤形成能力的影响。研究结果表明，所有受试菌株在pH 3.4条件下暴露3 h后均保持存活，但菌株间耐受程度存在显著异质性；其中3株（0421-1、1582-4和1711-4）在pH 2.6条件下仍可存活。酸胁迫对生物膜形成和上皮细胞黏附的影响呈菌株依赖性：菌株1711-4在pH 2.6暴露后生物膜形成能力显著下降，但其对HeLa细胞的黏附能力却显著增强；菌株0421-1的侵袭效率在酸胁迫后显著降低，而菌株1711-4的侵袭效率未受显著影响。荧光肌动蛋白染色（fluorescent actin staining，FAS）试验证实，两株受试菌株在酸胁迫后均保留了诱导AE损伤的能力。研究结论：aEPEC菌株对胃酸环境表现出显著的菌株间异质性，酸胁迫可差异性调控其毒力相关表型，但不损害其核心致病能力，提示酸耐受性可能是aEPEC成功定植肠道的重要适应性特征。

论文解读

一、研究背景与科学问题

肠致病性大肠埃希菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）是六种公认的致泻性大肠埃希菌致泻性大肠埃希菌（diarrheagenic E. coli）病型之一，其核心致病特征是通过在肠上皮细胞表面诱导attaching-effacing（AE）损伤——即微绒毛消失并在黏附细菌下方形成富含肌动蛋白的 pedestal 样结构——从而引发腹泻。根据是否携带EPEC黏附因子质粒（pEAF），EPEC被分为典型EPEC（tEPEC）和非典型EPEC（aEPEC）。近年来，tEPEC的发病率在全球范围内显著下降，而缺乏pEAF质粒的aEPEC已成为低收入国家卫生系统中最常诊断的致泻性大肠埃希菌病型，在5岁以下儿童和成人中均被频繁检出，无论是否伴随腹泻症状。

然而，aEPEC菌株在基因型和表型上高度异质，涵盖完全致病性菌株以及因缺乏特定毒力决定因子而表现减毒的菌株。这种异质性提示不同菌株在应激适应和生存策略上可能存在差异，进而影响其在感染过程中对环境胁迫的响应能力。

胃肠道定植是病原菌建立感染的关键前提。病原菌在到达肠道之前必须克服多重生理屏障，其中胃酸环境是摄入病原体面临的第一道防线。胃壁细胞分泌的盐酸造成高度酸性环境，对摄入的微生物施加显著胁迫。然而，胃内pH和通过时间随年龄、生理和病理状态以及饮食摄入而显著变化：空腹状态下，婴幼儿和儿童的胃内pH为1至3，成人约为0.5至2；进食后，由于食物的缓冲作用，胃内pH可升高至约5，从而可能降低病原体所承受的酸胁迫强度并促进其存活。

尽管酸耐受性已在共生性大肠埃希菌及多种致泻性大肠埃希菌病型中得到研究，但针对EPEC尤其是aEPEC的相关研究相对匮乏。鉴于aEPEC在全球范围内日益增长的流行病学重要性，明确不同遗传背景的aEPEC菌株在不同胃酸pH条件下的存活能力差异，以及酸暴露是否影响其生物膜形成、上皮细胞黏附与侵袭、AE损伤形成等毒力相关表型，具有重要的科学意义和公共卫生价值。

二、研究设计与技术方法

研究人员从圣保罗联邦大学微生物学系保藏的aEPEC菌株库（Cole??o de Enterobactérias EPM/CDC 89/90，编号C4EE214）中选取13株aEPEC菌株，这些菌株分离自1989至1990年巴西圣保罗地区1至4岁严重腹泻患儿的流行病学调查。以大肠埃希菌K-12 MA3456和tEPEC E2348/69分别作为黏附和FAS试验的阴性和阳性对照，以大肠埃希菌HB101和肠聚集性大肠埃希菌042分别作为生物膜形成的阴性和阳性对照。

主要技术方法包括：将处于对数生长中期的细菌分别暴露于pH 6.8（对照）、pH 3.4（中度酸胁迫）和pH 2.6（重度酸胁迫）的DMEM培养基中3小时，通过平板菌落计数（CFU）评估存活曲线；随后选取耐酸菌株进行中性pH恢复培养以模拟胃至十二指肠的转运过程；采用结晶紫染色法评估非生物表面的生物膜形成能力；以HeLa细胞为模型，通过May-Grünwald-Giemsa染色评估黏附模式，通过定量黏附试验和庆大霉素保护试验分别评估黏附效率和侵袭效率；采用荧光肌动蛋白染色（FAS）试验结合共聚焦显微镜定量评估AE损伤（pedestal）形成能力。

三、主要研究结果

3.1 aEPEC菌株耐受中度和重度酸胁迫

在pH 3.4条件下暴露3小时后，所有13株aEPEC菌株均保持存活，但存活曲线呈现明显差异。菌株0421-1、1582-4和1711-4在整个实验期间细菌浓度无显著下降，表现出较强的中度酸耐受能力；其余菌株虽有显著下降，但降幅均未超过1 log?? CFU/mL。在pH 2.6条件下，仅菌株0421-1、1582-4和1711-4在3小时后仍可检出活菌，尽管其细菌浓度下降幅度高达5 log?? CFU/mL；其余10株菌株在1至2小时内即丧失活力。对照菌株tEPEC E2348/69在pH 2.6下2小时后细菌浓度显著下降，而非致病性K-12菌株MA3456在暴露1小时内即完全失活。

3.2 aEPEC菌株在酸胁迫后恢复生长

选取菌株0421-1和1711-4进行酸胁迫后中性pH恢复实验。菌株0421-1在pH 3.4暴露后恢复期细菌浓度略有回升但未能完全恢复至初始水平；在pH 2.6暴露后虽出现约1.7 log?? CFU/mL的显著回升，但最终浓度仍较初始低约2.3 log?? CFU/mL。菌株1711-4在pH 3.4暴露后恢复效率较高，最终浓度与初始水平无显著差异；但在pH 2.6暴露后恢复能力有限，最终浓度较初始低约2.8 log?? CFU/mL。

3.3 酸胁迫差异性影响aEPEC菌株的生物膜形成

菌株0421-1在所有实验条件下均被归类为非生物膜形成菌株，酸胁迫未显著改变其生物膜表型。菌株1711-4在pH 6.8条件下为弱生物膜形成菌株，暴露于pH 2.6后生物膜生物量显著下降并转变为非生物膜形成表型，而pH 3.4暴露未产生显著影响。

3.4 酸胁迫不改变LAL黏附模式

两株菌株在酸胁迫后均保留了其特征性的localized adherence-like（LAL）黏附模式，HeLa细胞单层形态正常，未见细胞毒性效应。定性观察提示pH 2.6暴露可能增强细菌黏附，而pH 3.4暴露后的黏附模式与对照相当。

3.5 酸胁迫差异性影响aEPEC菌株的黏附效率

定量黏附试验显示，菌株0421-1在酸胁迫后其HeLa细胞黏附能力与对照无显著差异。菌株1711-4在pH 2.6暴露后细胞相关细菌数量较对照显著增加约5倍，而pH 3.4暴露无显著影响。

3.6 酸胁迫差异性影响aEPEC菌株的侵袭效率

两株菌株在所有条件下的侵袭效率均低于0.5%。菌株0421-1在pH 2.6和pH 3.4暴露后侵袭效率均显著低于对照。菌株1711-4在各条件下的侵袭效率无显著差异。

3.7 酸胁迫后诱导AE损伤的能力得以保留

FAS试验证实两株菌株在酸胁迫后均保留诱导AE损伤的能力。菌株0421-1在pH 2.6暴露后pedestal形成数量与对照无显著差异，但pH 3.4暴露后显著减少。菌株1711-4在pH 2.6暴露后pedestal形成数量显著增加，而pH 3.4暴露后与对照相当。

四、讨论与结论

研究讨论指出，所有受试aEPEC菌株均能耐受pH 3.4的中度酸胁迫，这可能反映了这些菌株对儿童宿主常见胃酸条件的适应性。重度酸胁迫（pH 2.6）则施加了更强的选择性压力，揭示了菌株间显著的异质性。酸耐受性可能涉及氨基酸脱羧途径、膜重塑、质子外排系统和DNA保护反应等多种酸抵抗机制的协同作用。值得注意的是，酸胁迫对生物膜形成和上皮细胞黏附的影响呈菌株依赖性，且同一菌株在不同表面相关表型上可表现出相反响应，提示这些表型受不同表面结构和调控通路支配。研究还强调，虽然HeLa细胞是评估LAL模式和FAS形成的成熟模型，但不能完全再现肠道上皮环境，未来需要采用肠道上皮模型进一步验证。

研究结论为：aEPEC菌株能够耐受胃样酸性条件，部分菌株在酸处理后能够恢复生长；酸暴露以菌株依赖性方式影响毒力相关表型，包括生物膜形成、上皮细胞黏附、侵袭和AE损伤形成。这些发现表明，酸性环境暴露可影响aEPEC与宿主互作相关的表型，酸耐受性可能是aEPEC成功定植肠道的重要适应性特征，其分子机制及与肠道定植的相关性有待进一步研究。