环二鸟苷酸通过靶向增强子结合蛋白 SfnR1 调控铜绿假单胞菌在硫限制条件下的生长

《Microbiological Research》：c-di-GMP targets the enhancer-binding protein SfnR1 to regulate Pseudomonas aeruginosa growth under sulfur limitation

　　**摘要**环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种广泛存在的细菌第二信使，通过直接结合转录调控因子或其他效应蛋白来调控多种生理过程。增强子结合蛋白（EBPs）是一类独特的转录调控因子，与σ54-RNA聚合酶协同作用，通过ATP水解促进下游基因的表达。迄今为止，在铜绿假单胞菌中，除FleQ外，尚未有报道其他EBPs能与c-di-GMP相互作用。通过系统筛选铜绿假单胞菌EBPs对c-di-GMP的结合能力，我们鉴定出SfnR1作为新的受体。已知SfnR1能促进msuEDC和sfnG的表达，使细菌在硫限制条件下利用非首选硫源（包括DMSO和DMSO?）。然而，SfnR1是否受c-di-GMP调控及其调控如何影响其转录活性仍不清楚。本文证明，c-di-GMP与SfnR1结合可阻止SfnR1与msuEDC和sfnG启动子结合，从而下调其表达。这损害了铜绿假单胞菌对非首选硫源的同化能力，最终限制了其在硫限制条件下的生长。相反，在正常条件下，铜绿假单胞菌中c-di-GMP水平的调节不影响生长。总之，我们的发现确立了c-di-GMP与SfnR1结合特异性限制硫限制下铜绿假单胞菌的生长，揭示了一种该第二信使调节细菌适应营养压力的新机制。**引言**作为关键的细菌第二信使，环二鸟苷酸（c-di-GMP）协调生物膜发育、运动性、毒力及其他生理过程（Liu等，2022）。在细菌中，c-di-GMP水平主要通过二鸟苷酸环化酶的合成和磷酸二酯酶的降解来维持（Baker等，2016）。作为机会性革兰氏阴性病原体，铜绿假单胞菌展现出显著的遗传可塑性和代谢多样性（Kida等，2020）。这些特征使其能在多种营养物上生长，并在土壤和海洋环境中广泛分布（Mielko等，2019；Dolan等，2020；Sauvage等，2022）。铜绿假单胞菌分泌多种毒力因子，包括绿脓素、多糖荚膜和弹性蛋白酶（Sauvage和Hardouin，2020；Qin等，2022）。大量报道表明，c-di-GMP通过靶向转录调控因子并改变下游基因表达来调节铜绿假单胞菌的表型，如毒力、生物膜形成和运动性（Chambers等，2014；Matsuyama等，2016；Kimbrough等，2020；Bense等，2022；Dubern等，2022）。然而，c-di-GMP的未知效应子及其在该菌中的生理功能仍有待探索。c-di-GMP的靶标包括增强子结合蛋白（EBPs），如FleQ、FlrA、BrfA、VpsR和BerB（Baraquet和Harwood，2013；Srivastava等，2013；Fazli等，2017；Hsieh等，2018；Guo等，2024）。EBPs是一类独特的σ54依赖性转录因子，具有AAA? ATP酶结构域和DNA结合结构域（Tucker等，2010；Fazli等，2017；Gao等，2020）。它们与σ54-RNA聚合酶及启动子DNA形成闭合复合物，并通过水解ATP提供将闭合复合物转化为开放复合物所需的能量，从而启动靶基因转录（Morett和Segovia，1993；Endoh等，2003a；Guo等，2024）。一个已被充分表征的能感受c-di-GMP的EBPs实例是包括铜绿假单胞菌和鞘氨醇假单胞菌在内的假单胞菌属转录因子FleQ（Baraquet和Harwood，2013；Baraquet和Harwood，2015；Xiao等，2016a）。c-di-GMP通过与FleQ相互作用抑制鞭毛生物合成基因的表达，从而抑制细菌运动性（Xiao等，2016b；Xiao等，2021；Barrios-Rafael等，2025）。尽管取得这些进展，但c-di-GMP能否靶向铜绿假单胞菌中的其他EBPs仍不清楚。除了其在生物膜发育和运动性中的作用，c-di-GMP还调节细菌的代谢途径（Lichtenberg等，2022；Wang等，2023）。正常情况下，细菌优先利用无机硫酸盐、硫代硫酸盐或半胱氨酸作为硫源（Hummerjohann等，2000；Lomans等，2002；Bentley和Chasteen，2004）。然而，当这些首选硫源缺失时，细菌会激活替代途径来代谢非首选硫源，如二甲基硫醚（DMS）、二甲基亚砜（DMSO）、二甲基砜（DMSO?）或甲砜（MSA），以维持生长（Cook等，1998；Kertesz，2000；Soule等，2020）。这些化合物是主要的生物源硫物种，来源于生态系统、人类活动和地质来源释放的DMS的光化学氧化产物，随后通过湿沉降沉积到地表（Holmes等，1997；Barnes等，2006；Carrión等，2015）。包括铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和鞘氨醇假单胞菌在内的几种细菌可以利用DMS及其氧化产物（DMSO、DMSO?、MSA）作为硫源生长（Endoh等，2003b；Endoh等，2005；Habe等，2007；Wicht，2016）。在铜绿假单胞菌中，当硫充足时，msuEDC和sfnG的表达受到抑制（Kertesz等，1999；Robinson等，2012）。在硫限制条件下，SfnR2驱动msuEDC-sfnR1操纵子和sfnG的表达，新合成的SfnR1进一步促进msuEDC和sfnG的表达，从而促进非首选硫源的利用（Tralau等，2007；Kouzuma等，2008；Lundgren等，2019）。然而，c-di-GMP是否影响铜绿假单胞菌的硫代谢仍不清楚。在此，我们在铜绿假单胞菌PAO1中筛选与c-di-GMP相互作用的EBPs，并鉴定出SfnR1作为新的受体。从机制上看，c-di-GMP结合抑制SfnR1在msuEDC和sfnG启动子上的DNA结合活性，从而下调其表达。因此，这损害了PAO1在硫限制下代谢非首选硫源的能力，并抑制细菌生长。总之，我们的发现揭示了c-di-GMP通过与EBP SfnR1结合调节硫限制下铜绿假单胞菌生长的分子机制，扩展了我们对c-di-GMP介导的代谢调节及其对营养压力下细菌适应性的影响的了解。**章节片段****菌株和生长条件**菌株、质粒和引物列于表S1和S2中。大肠杆菌在LB培养基中培养，根据需要添加四环素（17 μg/mL）、卡那霉素（55 μg/mL）或庆大霉素（16 μg/mL）。铜绿假单胞菌在TSB培养基中培养，添加庆大霉素（200 μg/mL）、四环素（150 μg/mL）或氯霉素（21 μg/mL）。本研究使用的醋酸盐最小培养基含有32 mM NaOAc、22 mM KH?PO?、42 mM Na?HPO?、18.8 mM NH?Cl、8.5 mM NaCl、1.1 mM MgCl?和6.0 μM FeCl?，并补充……**SfnR1是铜绿假单胞菌中的c-di-GMP结合EBP**在细菌中，转录因子是相对常见的c-di-GMP受体（Xiao等，2016a）。迄今为止，在铜绿假单胞菌中仅鉴定出FleQ作为c-di-GMP结合EBP（Su等，2015；Torres-Sánchez等，2023），但尚不清楚该菌的其他EBPs是否能结合c-di-GMP。为了鉴定能感受c-di-GMP的EBPs，我们系统筛选了铜绿假单胞菌PAO1中所有预测的转录因子，并鉴定出14个EBPs。在原核表达后……**讨论**c-di-GMP是一种关键的细菌第二信使，调节多种生理过程（Jenal等，2017；Liu等，2022；Zhang等，2025）。尽管转录因子是细菌中最常见的c-di-GMP效应子类别之一（Jenal等，2017；Mao等，2025），但c-di-GMP响应性转录因子通常缺乏共同的c-di-GMP结合基序，因此必须通过实验方法进行鉴定（Huo等，2026；Guo等，2024）。在此，我们……**结论**总之，本研究确立了一个调控模型，即c-di-GMP特异性结合SfnR1并抑制其与msuEDC和sfnG启动子的相互作用，从而抑制基因表达，限制非首选硫源的利用，并减弱硫限制下铜绿假单胞菌的生长。本工作不仅揭示了c-di-GMP在生长方面的新功能，还强调了EBPs作为整合多种环境信号中枢的多样性……**CRediT作者贡献声明****孙凯：** 撰写——原稿、可视化、验证、软件、方法论、研究、形式分析、数据整理。**张恒：** 可视化、验证、方法论、形式分析。**毛连英：** 可视化、验证、方法论、研究。**钱心宇：** 可视化、验证、方法论、研究。**张磊：** 撰写——审阅与编辑、可视化、监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念构思。**利益冲突声明**作者声明不存在利益冲突。**致谢**本工作由中国国家自然科学基金（32370134和32170048）以及陕西省自然科学基金基础研究计划（2023-JC-JQ-18）资助。感谢西北农林科技大学生命科学学院教学科研核心设施范宁娟、段辉及西北农林科技大学生命科学研究核心服务李露琪提供的专业技术支持。**孙凯 | 张恒 | 毛连英 | 钱心宇 | 张磊**