《Cell Biochemistry and Function》：Overview on Epstein–Barr Virus–Host Interactions With a Focus on Host Cell Transcriptome Alterations
EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）属于人类疱疹病毒γ亚群。EBV在潜伏感染方面具有显著的嗜淋巴细胞性，即其优先靶向淋巴细胞作为免疫生态位。在复杂病毒-宿主关系的建立过程中，病毒借助多种病毒编码分子（如microRNA、lncRNA、肽段和蛋白质）影响人类宿主细胞转录组，诱导RNA数量及质量的改变。宿主感染细胞人类基因表达的定量改变源于表观遗传机制，如启动子甲基化模式改变，以及基于microRNA或lncRNA的转录后基因调控机制的改变。人类转录组的定性改变包括化学性RNA修饰变化及选择性剪接（alternative splicing, AS）模式的改变。这些分子机制促进了EBV的免疫逃逸、增强了宿主细胞增殖并降低了细胞对凋亡诱导的敏感性。上述机制与感染宿主细胞的恶性转化过程高度相关，凸显了EBV的致瘤潜能。本综述旨在探讨AS在EBV感染宿主细胞恶性转化中的作用。为此，研究人员以EBV拷贝数依赖性方式分析了来自EBV阳性人类伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma, BL）的公开转录组数据集。研究人员鉴定了14个直接失调的剪接因子，主要为剪接体组成成分及反式作用剪接因子，这些因子对于病毒介导的宿主细胞剪接模式改变具有潜在相关性。
**1 人类疱疹病毒概述及其关键特征**
人类疱疹病毒的8种代表性病毒株为有包膜病毒，其基因组由双链DNA构成。不同病毒株的基因组大小各异，从水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus, VZV, HHV-3）的125千碱基对（kilobase pairs, kbp）至巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV, HHV-5）的235 kbp不等。这些大型病毒基因组编码大量基因，并可由此产生更多编码及非编码转录本。非编码转录本、病毒肽段和蛋白质用于建立复杂的病毒-宿主相互作用。HHV在全球人群中的感染率可高达90%以上，并伴有有时极长的潜伏期（某些HHV可终身潜伏），这归因于复杂且高度特化的病毒-宿主相互作用。
初次感染（常发生于儿童早期）后，HHV以特定宿主细胞群体作为终身免疫生态位。在HHV中，人类EB病毒（EBV, HHV-4）的全球感染率最高，超过90%，可引起传染性单核细胞增多症（又称亲吻病）。玫瑰疹病毒（HHV-6A/B）同样在儿童早期获得感染，被认为是幼儿急疹的病原体，其全球血清阳性率亦高达90%以上。VZV的血清阳性率存在显著地域差异，发展中国家仅少数地区超过90%，而欧盟国家等地区检出率显著较低，这与国家疫苗接种政策或可用疫苗选择有关。气候亦影响VZV血清阳性率及平均感染年龄，并可能关联VZV所致疾病的病程和严重程度。CMV血清阳性率在工业化国家（39%）与发展中国家（> 90%）间差异显著。单纯疱疹病毒1型（HSV-1, HHV-1）在工业化国家（欧洲低于5%）与发展中国家（非洲约50%）感染率不同；单纯疱疹病毒2型（HSV-2, HHV-2）血清阳性率较低，约为13%。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV, HHV-8）的血清阳性率亦呈现极强地域差异，从高度流行区（撒哈拉以南非洲国家50%–80%）至低流行区（工业化国家< 5%）。
与其他HHV相比，EBV即使在工业化国家感染率亦极高。现有大量关于EBV生命周期依赖性基因表达谱及病毒分子对感染宿主细胞影响的数据。因此，本综述以EBV作为其他HHV的代表性范例。
**2 建立有效免疫生态位作为复杂病毒-宿主关系的结果**
HHV在全球不同气候和种族群体中的高感染率及其建立终身潜伏的能力，以高度适应各宿主细胞类型的密切病毒-宿主关系为前提。既往研究聚焦于特定病毒编码分子，如病毒蛋白、肽段、长非编码转录本和病毒编码microRNA。然而，病毒-宿主分子相互作用的分析亦须考虑感染宿主细胞的转录组。病毒诱导的改变不仅引起宿主转录本简单的定量上调和下调，还导致定性RNA改变，如选择性剪接改变和推定RNA修饰。
这些复杂的多因素、多层次病毒-宿主分子相互作用（如免疫逃逸中的相互作用）可追溯至约1.8–2亿年的共进化。α亚群包括HSV-1/2和VZV，可在宿主感觉神经节神经元中建立潜伏。β亚群的代表CMV和三种玫瑰疹病毒在单核细胞/巨噬细胞中建立潜伏，CMV感染CD34阳性造血前体细胞及其CD34阴性衍生物。玫瑰疹病毒在CD4阳性T淋巴细胞中建立潜伏，该亚群成员亦可在唾液腺上皮细胞中潜伏。EBV和KSHV为γ亚群的两个代表，在潜伏建立方面尤其具有嗜淋巴细胞性。KSHV可感染B淋巴细胞及血管和淋巴管内皮细胞。EBV感染B、T、NK淋巴细胞及鼻咽上皮细胞。此外，γ疱疹病毒具有致癌潜能。
从病毒-宿主关系角度，疱疹病毒在共进化中分为三个亚群并各自拥有免疫生态位，对其潜伏感染至关重要。疱疹病毒并非采取快速感染和传播的"打了就跑"（hit and run）策略，而是旨在免疫逃逸的"停留与低平"（stay and low）策略，并在宿主免疫系统减弱时进入增殖阶段。
**3 EBV驱动复杂的病毒-宿主相互作用以重编程宿主细胞**
病毒-宿主分子相互作用根据病毒生命周期阶段（潜伏期和裂解期）的不同而服务于不同目的。EBV作为感染性颗粒，由封装于二十面体蛋白壳（衣壳）内的线性双链基因组组成。衣壳主要由五种病毒蛋白构成：主要成分BCLF1及稳定因子BFRF3、BORF1、BDLF1，以及病毒衣壳门户蛋白BBRF1。其下为称为被膜的无定形区域，含有对早期感染及病毒组装和从宿主细胞释放具有关键作用的病毒编码蛋白。病毒粒子的外层脂质包膜来源于裂解期释放病毒粒子的宿主细胞，该脂双层可包含多达11种额外的病毒编码糖蛋白。EBV利用不同糖蛋白感染不同靶细胞。为感染B细胞，病毒利用其最丰富的糖蛋白gp350（BLLF1），与B细胞上的CD21/CD35相互作用。此外，糖蛋白gH（BXLF2）、gL（BKRF2）和gp42（BZLF2）形成三聚体复合物，能够结合B细胞上的HLA-II分子。从裂解B细胞释放后，产生的EBV病毒粒子表达极少量甚至不表达gp42，这有助于口咽和鼻咽上皮细胞的高感染率。上皮细胞感染利用剩余的gH/gL异二聚体，可与上皮细胞上的EPHA2相互作用。
EBV生命周期可分为裂解期和潜伏期；潜伏期根据不同的基因表达谱可进一步分为0、I、II和III型。潜伏0型为限制性最强的潜伏类型，病毒可静默存续，有时持续宿主终生，不表达蛋白编码病毒基因。此期表达的非编码RNA（ncRNA）包括两种长非编码RNA（lncRNA）EBER1和EBER2及多种EBV microRNA（miR）。miR为18–22 nt长的单链RNA，含有对其靶标（宿主）mRNA特异的结合序列，miR结合通常发生在3′-UTR，导致翻译抑制和miR结合后mRNA降解。EBV基因组中miR基因成簇存在，可分三个簇：BHRF1簇（4个miR）、BART1簇（14个miR）和BART2簇（26个miR）。潜伏0期表达两个BART簇的miR，而BHRF1簇几乎保持不活跃。
潜伏I期除ncRNA外仅表达EBNA1。潜伏II期除EBNA1和ncRNA外还表达LMP1、LMP2A和LMP2B。仅潜伏III期表达全部潜伏EBV基因，包括六种EBV核抗原（EBNA1/2/3A-3C/LP）、三种潜伏膜蛋白（LMP1/2A/2B）及ncRNA。
EBV裂解期亦可细分。即刻早期阶段起始时，病毒转录因子BZLF1（Zta）和BRLF1（Rta）表达，进而驱动更多靶基因转录。随后早期阶段主要表达参与病毒基因组复制的酶。随后的晚期阶段表达编码病毒粒子组装蛋白的病毒基因以及最终触发宿主细胞裂解和病毒粒子释放的裂解因子。
病毒通过多种平行分子策略在每个生命周期阶段实现充分免疫逃逸，并产生叠加效应。这种多因素策略不仅针对免疫逃逸，如下调感染宿主细胞表面的HLA-Ia介导的抗原呈递（如病毒编码的ebv-miR-BHRF1-3下调TAP2），还包括下调细胞应激标志物，如通过ebv-miR-BART2-5p下调重要的NKG2D配体MICB以及通过ebv-miR-BART7下调MICA。此外，EBV miR参与下调抗病毒和促炎细胞因子，如ebv-miR-BART7-3p下调IFNL3、ebv-miR-BART16下调I型干扰素信号。EBV编码的长非编码（lnc）转录本亦参与免疫逃逸，据报道EBER1和EBER2转录本可稳定EBV阳性B细胞中抗炎细胞因子IL-10的mRNA。
在裂解期，产生大部分病毒编码肽段和蛋白质。其中许多分子具有免疫调节功能，如由BCRF1基因编码的病毒（v）IL-10，可减少感染B淋巴细胞经HLA-I和-II分子的肽段呈递，并抑制多种促炎和抗病毒细胞因子的分泌，如IFN-γ、I型干扰素、TNF-α、IL-2和IL-12。vIL-10还有效抑制T和NK淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫效应细胞，同时刺激感染B细胞并促进其增殖。
EBV通过类似的分子机制不仅能诱导感染宿主细胞的免疫逃逸，还可同时促进病毒刺激的B细胞增殖和抗凋亡基因表达增强，同时抑制宿主细胞的促凋亡和抗增殖因子。这些对感染宿主细胞至关重要的功能改变亦是恶性肿瘤转化的标志。
EBV可在感染组织中诱发某些恶性肿瘤。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）和伯基特淋巴瘤（BL）在90%以上病例中为EBV阳性，EBV通过诱导基因组不稳定性、突变积累和表观遗传重编程参与其发病机制。
**4 EBV感染改变宿主细胞转录组**
EBV表达的调控分子数量庞大，不可避免地导致宿主细胞转录组高度改变。这些改变不仅引起宿主细胞mRNA丰度的定量变化，还导致宿主细胞转录组的定性变化，包括mRNA剪接模式改变。
EBV诱导的宿主细胞转录组改变的多种原因始于DNA水平，例如编码基因启动子区域的甲基化或去甲基化改变。这些过程直接激活JNK/AP-1信号通路、NF-κB信号通路、MAPK通路和Wnt/β-catenin通路，例如通过沉默WNT抑制剂，导致EBV阳性宿主细胞增殖增加、细胞迁移、侵袭性增强和凋亡诱导性降低，从而促进恶性转化。EBV介导的DNA甲基化对这些宿主细胞通路的改变具有重要意义，因为EBV同时以其他EBV编码分子平行靶向相同通路。
在所有病毒生命周期阶段表达的非编码EBV转录本（如lncRNA或miR）亦与宿主细胞转录组相关。研究表明，几种最丰富的EBV miR调节WNT通路及EGF和FGF等生长因子通路，如ebv-miR-BHRF1-1、ebv-miR-BART1、ebv-miR-BART4和ebv-miR-BART17。其他EBV-miR相互作用包括ebv-miR-BART1额外激活AKT和MAPK，以及ebv-miR-BART13促进NF-κB信号传导。此外，lncRNA EBER1和EBER2调节JNK和NF-κB通路。
**5 EBV诱导的效应不仅影响RNA数量还影响RNA质量**
病毒编码分子不仅通过启动子甲基化或去甲基化在转录水平引起宿主细胞转录组的定量改变（如基因表达增减），还通过病毒miR、lncRNA、肽段或蛋白质在转录后水平发挥作用。此外，还可观察到宿主细胞转录组的定性改变，包括剪接模式改变和化学性RNA修饰。
人类转录本最重要的化学修饰包括RNA甲基化、乙酰化和假尿苷化，这些修饰影响RNA的稳定性、剪接和翻译等特性。目前文献中关于此主题的数据极少。研究表明EBV感染宿主细胞中的病毒转录本亦被宿主细胞酶修饰，如RNA m6A甲基化。事实上，EBV甚至激活细胞m6A修饰以促进裂解周期中的细胞存活和病毒产生。关于EBV感染背景下其他RNA修饰尚无文献数据。
一个极具前景的研究领域是病毒修饰的EBV感染宿主细胞内选择性剪接模式的影响。除组成性剪接（mRNA成熟过程中内含子剪接后外显子连接的简单剪接）外，还可区分选择性剪接（AS）。除简单内含子保留外，还鉴定出四种其他AS机制：外显子跳跃、选择性5′剪接位点、选择性3′剪接位点和协同外显子剪接。这些机制产生大量不同的剪接变体。对于AS，除mRNA序列上的顺式作用元件外，反式调控因子尤其重要，包括某些RNA结合蛋白（RBP），可作为增强子或沉默子促进或抑制外显子的AS。已知多个RBP家族，其中一些甚至以组织特异性方式控制AS。例如SR蛋白家族（包括SRSF2等）倾向于作为增强子；hnRNP家族成员则更常为沉默子。CELF、RBOX、NOVA、MBNL和PTBP家族的代表以组织特异性方式、某些情况下以年龄依赖性方式（如胎儿组织）影响AS。
EBV对宿主细胞AS的影响始于lncRNA EBER1和EBER2的表达，它们本身能够改变多种宿主细胞mRNA的选择性剪接。Pimienta等（2015）通过RNA测序分析结合EBER1/2过表达，鉴定出379个发生统计学显著AS改变的mRNA。Lee等（2012）证明EBV lncRNA EBER1是反式剪接因子hnRNPD（AUF1）的直接结合伴侣，该因子还可影响其他宿主细胞转录本的RNA稳定性。同一研究还鉴定hnRNP A1和hnRNP A2/B1为EBER1相互作用伴侣。对于EBER2，至少证明其可结合某些已知参与AS反式调控的RBP（NONO、SFPQ、RBM14）。EBV蛋白SM亦被认为能够影响某些宿主细胞mRNA（如STAT1 mRNA）的AS。Chua等（2022）证明EBV蛋白EBNA1、Zta和Rta影响TSG101 pre-mRNA的AS，从而促进恶性转化。Park等（2018）报道在EBV复制期间，某些细胞反式剪接因子（SRSF2、SRSF3和Son）和RBP（ALY、NXF1和Y14）可被招募至所谓病毒诱导结节结构（VINORC），从而对宿主细胞转录本及其AS产生竞争性效应。
Armero等（2017）比较了癌症基因组图谱（TCGA）中26个EBV阳性胃腺癌组织与相应EBV阴性样本，鉴定出发生AS改变的转录本，并确定33个AS相关基因为差异表达。Homa等（2013）报道EBV转化细胞与未感染B细胞相比，3′ UTR显著缩短和盒式外显子排除，但该研究使用cDNA微阵列分析而非RNA测序。
**6 对来自伯基特淋巴瘤患者TCGA数据集的分析**
已有研究表明EBV影响感染宿主细胞的AS，初步揭示了潜在分子调控机制，包括人类反式剪接因子的失调。但现有研究均未具体探讨EBV拷贝数如何影响AS改变。研究人员提出假说：感染宿主细胞中EBV拷贝数越高，宿主细胞转录组失调越严重。EBV拷贝数与病毒生命周期阶段相关，从潜伏期至裂解期拷贝数急剧上升。即使在潜伏期，感染宿主细胞中的EBV拷贝数也可相差100倍。为此，研究人员分析了EBV阳性伯基特淋巴瘤样本，数据评估特别检查了宿主细胞基因失调与EBV拷贝数的关系，重点关注与AS具有推定功能相关性的失调宿主细胞基因。
研究者使用伯基特淋巴瘤基因组测序项目（BLGSP）（项目ID: CGCI-BLGSP；数据集登录号: pht001132.v19.p6）的RNA-Seq数据。由于BL细胞主要处于EBV潜伏I期，仅表达有限数量的EBV编码分子，但感染细胞间EBV拷贝数可能存在较大差异，很可能导致相应基因剂量效应。
分析采用以下近似方法：BL中超过90%为EBV阳性，但数据集仅针对人类转录组比对，不含病毒转录本信息。因此选择四个人类基因（NF-κB、HIF1α、MYC、AICDA），其转录本拷贝数与感染宿主细胞内EBV拷贝数相关。对每个基因分别进行分析，使用BL样本中每个基因表达量最高的10%和最低的10%。通过计算统计学显著性（错误发现率（false discovery rate, FDR）< 0.05）鉴定失调基因，随后对先前统计学显著的失调基因进行Log2倍变化（Log2fold change, LFC）计算（截断值LFC < 0.5和LFC > 2.0），以热图可视化。随后使用韦恩图鉴定在所有四个分析组中统计学显著上调（n = 633）或下调（n = 27）的基因。对统计学显著失调基因，使用NCBI网站手动注释已知功能，发现其中14个基因直接参与RNA剪接，另有4个基因编码RBP，其中PRMT8特别直接参与RNA甲基化。
在RNA剪接因子中，不仅包括孤立的反式调控剪接因子（如A1CF、HNRNPF和SRRM4），还包括众多与剪接机器本身直接相关的核心元件：RNU4-1、RNU4-2、RNU5B-1、RNU5D-1、RNU6ATAC、RNVU1-18、RNVU1-2、RNVU1-28、RNVU1-31、RNVU1-7和SNRPB。鉴定的失调snRNA涉及主要剪接体（U2依赖性剪接体，特别是RNU4-1、RNU4-2、RNU5B1和RNU5D-1）和次要剪接体（U12依赖性剪接体，特别是RNU6AT）。这些发现提示EBV感染不仅可能失调选择性剪接，还可能在某些特定位点失调组成性剪接，但需进一步深入分析和验证。
表1中14个失调剪接因子和2个额外失调的一般RBP大部分编码于1号染色体，统计学上显著超过该染色体基因编码的统计预期（p = 0.027）。
值得注意的是，独立于EBV感染，许多这些RBP和剪接因子已在多种肿瘤疾病中被鉴定为失调。这些数据支持EBV感染确实对AS具有高度相关性的假说。感染宿主细胞内单独的病毒拷贝数（即使在不同组织中）即可导致众多对AS具有功能相关性的RBP基因表达改变，这可能对恶性转化的分子过程具有重要意义。
然而，这种间接方法存在局限性并依赖于简化假设。最佳方案是利用特异性EBV转录本进行样本特异性标准化因子计算以估计EBV阳性肿瘤中的EBV拷贝数。值得注意的是，EBER1和EBER2 lncRNA以及某些EBV miR在EBV生命周期所有阶段均表达；理论上可从原始RNA测序数据中鉴定，但该信息已无法从已比对至人类转录组的TCGA文件中检索。采用的间接方法使用其他人类标志基因存在严重局限性。NF-κB、HIF1α、MYC和AICDA等基因即使在EBV阴性肿瘤疾病中也经常失调和突变，在EBV阳性肿瘤中也可能独立于病毒本身发生。另一个方面是这些因素可相互影响，如NF-κB可诱导HIF1α表达。基于已鉴定失调因子的进一步计算机数据分析可导致鉴定差异剪接的宿主细胞mRNA，但考虑到分析中的许多简化，进一步的计算机分析应基于已用分子生物学方法（如qPCR和Western blot）验证的失调靶标。
**7 材料与方法**
**7.1 数据集**
用于计算机分析的BL原发性肿瘤RNA测序（RNA-Seq）数据获取自伯基特淋巴瘤基因组测序项目（BLGSP），该项目为癌症基因组表征计划（项目ID: CGCI-BLGSP；数据集登录号: pht001132.v19.p6）的一部分。STAR比对基因水平计数于2026年4月从开放获取的基因组数据共享（GDC）数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov）下载。初始查询包含283个RNA测序文件，仅筛选原发肿瘤集后提取257例，去除患者重复后剩余196例用于差异基因表达分析（DESeq）。
**8 数据分析**
差异表达分析（DE）及下游分析可视化在R（版本4.5.3）中使用Bioconductor实现（发布版本3.22；BiocManager 1.30.27）及ggplot2（V 4.0.3）进行。DE数据集使用TCGAbiolinks（V 2.38.0）下载。为鉴定BLGSP病例中的转录改变，进行了四次DE分析，每次采样四个病毒相关基因之一：AICDA、MYC、HIF1α和NFKB1。每组内将196个样本中原始表达量最高的10%与最低的10%进行比较，0.1分位数定义最低10%（n = 20），0.9分位数定义最高10%（n = 20），每次分析共40个样本。
**8.1 差异表达分析**
原始过滤计数使用DESeq. 2（V 1.50.2）进行DE分析。基因定义为差异表达的标准为FDR ≤ 0.05，上调基因LFC > 2，下调基因LFC < 0.5。表达模式可视化使用与DE相同的截断值。
**8.2 热图**
应用方差稳定化变换（VST）和z-score标准化以可视化样本间表达模式（ComplexHeatmap; V 2.26.1）。
**8.3 交集分析**
DESeq. 2结果以韦恩图显示，在组定义基因内筛选共同共享的差异表达基因（VennDetail; V 1.26.1）。
**功能富集分析**
功能富集分析基于交集分析，使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）以基因过滤器手动注释功能。作为额外过滤器，选择转录组相关基因提交至ShinyGO 0.85.1（https://bioinformatics.sdstate.edu/go/）进行染色体定位分析。基因列表连同相应背景列表（含GDC获得初始数据集中的所有基因）一并提交。
**9 结论**
EBV病毒感染后立即开始不仅操纵感染人类宿主细胞内的单个靶基因甚至特定细胞通路。为此，病毒利用其多种病毒编码分子在多个调控水平（包括基因组、转录组和蛋白质组）诱导宿主细胞的广泛重编程。这种重编程导致免疫逃逸、细胞增殖和凋亡抵抗增强。然而，由于其分子相互作用能力，EBV还不可避免地可为宿主细胞的完全恶性转化铺平道路。这些结果不仅旨在支持该假说，还鼓励进一步科学研究致力于这一尚未充分研究的分子生物学主题。
