生物正交化学在神经生物学中的应用：从成像到蛋白质组学

《ChemBioChem》：Bioorthogonal Chemistry in Neurobiology: From Imaging to Proteomics

　　

生物正交点击化学已成为一种多功能方法，能够以高选择性和最小扰动探测分子。虽然该方法适用于多种生物分子，但其在蛋白质研究中的应用已被证明尤为强大，尤其是在神经生物学中——在该领域中，精确的分子工具至关重要。实现这种精度的关键技术是基因密码扩展（genetic code expansion, GCE），它允许将携带生物正交手柄的非天然氨基酸（unnatural amino acids, UAAs）掺入蛋白质。这些UAAs可以被位点特异性地引入以标记特定蛋白质，或在整个蛋白质组范围内引入以进行系统级分析。与此互补，全蛋白质组标记可通过氨基酸类似物的代谢掺入实现。结合铜催化的或应变促进的点击反应，这些标记技术可实现从蛋白质可视化到基于质谱的蛋白质组学等多种应用。UAA掺入策略的持续进展和可用UAA的化学多样性不断拓宽了研究蛋白质表达、定位和动态变化的机会。在本综述中，研究人员重点综述了基于点击化学的蛋白质标记方法学的最新进展及其在神经生物学中的应用。

1 引言

生物正交点击化学是在生理条件下进行且不干扰天然生物过程的化学反应，需兼具高化学选择性和生物相容性。铜催化的叠氮–炔环加成（CuAAC）由Sharpless和Meldal独立发展，是点击化学的重要里程碑，但Cu(I)的细胞毒性限制了其在活体内的应用。为此，Bertozzi等发展了无催化剂的Staudinger连接和应变促进叠氮–炔环加成（SPAAC），随后又发展了基于四嗪的应变促进逆电子需求Diels–Alder环加成（SPIEDAC），这些反应具有快速动力学和优异选择性。生物正交标记通常采用两步流程：先将非天然化学手柄通过代谢掺入或遗传方法引入生物分子，再通过点击反应偶联报告探针。在神经生物学中，生物正交化学已应用于核酸、聚糖、脂质等研究，例如用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）检测增殖细胞，用5-乙炔基尿苷（EU）标记新生RNA，以及聚糖代谢标记等。此外，配体定向生物正交标记策略（如LDAI试剂）可在活体小鼠脑中无遗传操作地标记内源性神经递质受体。本综述重点总结基于点击化学的蛋白质标记方法在荧光显微镜和蛋白质组学中的最新进展。

2 生物正交手柄的蛋白质掺入

基因密码扩展（GCE）利用正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，将非天然氨基酸（UAAs）位点特异性地掺入目标蛋白。哺乳动物中最常用的是来自甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酸特异tRNA^Pyl/PylRS对。常用的UAA包括含叠氮、四嗪、环辛炔（SCO）、双环壬炔（BCN）、环丙烯（CP）、反式环辛烯（TCO）等赖氨酸衍生物，它们可通过SPAAC或SPIEDAC进行蛋白质标记。随机正交重编码翻译（SORT）利用识别有义密码子的正交tRNA，在全蛋白质组水平随机掺入UAA。与GCE互补，代谢标记方法如生物正交非经典氨基酸标记（BONCAT）和荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT）利用甲硫氨酸类似物高炔丙基甘氨酸（HPG）或叠氮高丙氨酸（AHA），经内源翻译机制掺入蛋白质。此外，可点击的嘌呤霉素类似物O-炔丙基嘌呤霉素（OPP）可标记新生肽链。

3 用于荧光显微镜研究的生物正交点击化学

荧光显微镜需要将荧光团尽可能靠近目标蛋白，传统的荧光蛋白标签或抗体较大，可能干扰蛋白质功能。GCE结合SPIEDAC可实现位点特异性的小分子染料标记，且四嗪-荧光团具有荧光生成特性，降低背景。SPIEDAC反应速率快，适合活细胞标记。早期研究在哺乳动物细胞中标记了表皮生长因子（EGF）、胰岛素受体和流感病毒血凝素。在原代神经元中，研究实现了神经丝轻链（NFL）的STED和STORM成像，并通过CRISPR/Cas9基因编辑标记内源性NFL。另一种方法用于标记跨膜AMPAR调节蛋白（TARP），利用细胞不可渗透的四嗪染料标记被遮蔽的表位。对于大型跨膜蛋白如神经黏附分子NF186和电压门控钠通道Na_v1.6，研究者使用腺相关病毒（AAV）递送GCE系统，提高了标记效率。FUNCAT通过CuAAC将荧光染料偶联到新合成蛋白上，可在海马神经元中实现双时间窗标记。OPP类似物结合光笼技术，可实现时间和空间可控的新生蛋白标记。

4 用于蛋白质组学研究的生物正交点击化学

传统定量蛋白质组学缺乏细胞特异性，而BONCAT利用内源翻译机制掺入AHA/HPG，然后通过CuAAC偶联生物素进行富集。BONCAT已应用于原代海马神经元、多巴胺能调节的神经毡蛋白质组、癫痫诱导的蛋白合成等研究，并扩展至活体动物如非洲爪蟾脑、大鼠视神经和小鼠脑。基因编码的BONCAT通过工程化甲硫氨酰-tRNA合成酶（MetRS）突变体（如MetRSL274G）特异性识别叠氮正亮氨酸（ANL），在Cre-loxP系统中实现细胞类型特异性标记。THRONCAT使用苏氨酸类似物β-乙炔基丝氨酸，可被内源苏氨酰-tRNA合成酶高效识别，无需氨基酸去除。SORT通过正交aaRS/tRNA对重新分配有义密码子，实现在完整培养基中全蛋白质组UAA掺入，SORT-E利用可切割四嗪-生物素探针富集标记蛋白。SORT已被用于脑切片和活体小鼠纹状体神经元的蛋白质组分析。

5 当前挑战与展望

尽管生物正交标记具有高选择性和低扰动，仍面临挑战：遗传编码UAA系统的递送效率不高，UAA的体内摄取和生物利用度有限，点击反应需平衡动力学、生物相容性和探针大小。

5.1 荧光显微镜

UAA策略可实现最小化标记，尤其适合超分辨显微镜（SRM），减少连接误差。但GCE在原代神经元中的转染效率低，且琥珀抑制效率依赖于序列背景。优化策略包括先在永生化细胞系（如ND7/23、N1E-115、HEK293T）中验证，再转至原代细胞；或使用病毒转导、电穿孔、稳定细胞系（如PiggyBac转座）。内源标记可通过CRISPR/Cas9敲入含琥珀密码子的标签、RNA编辑或split intein介导的蛋白质编辑实现。生物正交标记已用于构建FRET传感器监测代谢型谷氨酸受体的构象变化，以及可视化淀粉样前体蛋白（APP）的蛋白水解加工和淀粉样-β（Aβ）生成。

5.2 蛋白质组学

BONCAT和SORT是神经蛋白质组学的主要方法。BONCAT受内源甲硫氨酸竞争限制，改进包括多拷贝MetRS转基因小鼠（3×MetRS*）和光激活ANL类似物（Opto-ANL）。THRONCAT无需基因工程但不能实现细胞类型特异。SORT可通过选择多个有义密码子提高覆盖度，但需要递送正交tRNA/aaRS，复杂性较高。对于不依赖新生蛋白合成的分析，近程标记方法如BioID、APEX2和TurboID可能更合适；多尺度光催化近程标记平台MultiMap可调节标记半径，有望用于突触蛋白组织研究。未来结合近程标记与新生蛋白标记方法，将更全面地描绘神经系统的蛋白质组和相互作用组。