靶向雄激素受体（AR）的姜黄素类似物设计合成及其对去势抵抗性前列腺癌细胞的AR-FL/AR-V7选择性抑制

《Chemical Biology & Drug Design》：Synthesis of Curcumin Analogs Targeting Androgen Receptor for the Selective Inhibition of Castration-Resistant Prostate Cancer Cells

　　

在本研究中，研究人员设计并合成了一系列姜黄素类似物（A1–P3），通过靶向雄激素受体（androgen receptor, AR）抑制前列腺癌细胞。所有合成化合物均通过¹H NMR、¹³C NMR和高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS）进行结构表征。体外细胞毒性实验表明，与二甲基姜黄素（dimethylcurcumin, DMC, ASC-J9）相比，多个化合物对AR阳性22Rv1细胞表现出相当或改善的细胞毒性。其中，化合物A2、A3、B1–B3、D1、F1、F3、G1、G3、H1和P3对前列腺癌细胞的选择性高于DMC。化合物O1–O3、A1–A3、B1–B3、F1、F3、G1、I1和P3对AR阴性PC-3细胞的细胞毒性低于对22Rv1细胞的细胞毒性。基于细胞毒性结果，研究人员分析了结构–活性关系（structure–activity relationships, SAR）。在AR蛋白抑制实验中，与DMC相比，化合物O1–O3、A1–A3和I1对全长AR（full-length AR, AR-FL）和AR剪接变异体7（AR splice variant 7, AR-V7）表现出相似的抑制作用，而化合物P3对AR-FL的抑制效果较DMC显著增强。相比之下，与DMC相比，化合物B2、B3、F1和F3对AR-FL和AR-V7的抑制效果降低；B1和G1对AR-FL和AR-V7无显著抑制作用，提示这些化合物可能通过多种机制抑制前列腺癌细胞。分子对接模拟进一步证实，化合物O1–O3、A1–A3、I1和P3对AR具有高靶向能力。这些化合物与AR的可能结合模式也被揭示。通过修饰姜黄素的分子结构，本研究鉴定出若干化合物（A2、A3、P3），其通过靶向AR-FL和AR-V7对去势抵抗性前列腺癌细胞具有高抑制活性和选择性。这三种化合物是去势抵抗性前列腺癌药物发现的有前景的新候选物。

研究背景方面，姜黄素（curcumin）是姜黄属Curcuma longa L.根茎中代表性天然多酚类活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒等药理活性，可通过调控NF-κB、STAT3、WNT/β-catenin等信号通路抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，并通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。然而，天然姜黄素存在水溶性差、体内代谢快、口服吸收效率低和生物利用度不理想等问题，且其固有抗肿瘤活性有限，限制其进一步临床应用。因此，以姜黄素为先导结构进行理性修饰，设计合成活性与成药性改善的新型衍生物，已成为抗肿瘤新药研发的重要方向。二甲基姜黄素（dimethylcurcumin, DMC, ASC-J9）可选择促进雄激素受体（androgen receptor, AR；介导雄激素信号转导的核受体）降解，抑制AR信号通路激活，对去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）细胞具有显著抗增殖作用，并可降解全长AR（full-length AR, AR-FL）、靶向AR剪接变异体等耐药突变，同时通过非AR依赖途径抑制STAT3磷酸化。Liu et al. 报道了一系列姜黄素衍生物作为AR抑制剂，其中多个化合物对22Rv1细胞具有优异抑制作用。Zhou et al. 于2016年报道了姜黄素吡啶类似物，其中FN组对22Rv1细胞生长和AR激活的抑制作用最强；Zhou et al. 于2014年报道了含不同连接子的姜黄素类似物，可抑制22Rv1和LNCaP细胞生长、诱导凋亡并阻断AR激活。Gong et al. 报道了含卤素或氮原子的姜黄素衍生物，证明多个化合物对22Rv1细胞的抑制活性优于DMC。Belluti et al. 报道了含邻苯二甲酰亚胺基团的新型姜黄素衍生物，并评价其稳定性、药效、自由基清除能力及对侵袭性前列腺肿瘤细胞的抗增殖活性。基于上述研究，姜黄素衍生物在抑制CRPC进展和转移方面具有应用前景。

研究人员以姜黄素为先导化合物，对其苯环取代基和β-二酮部分进行结构修饰，设计并合成一系列姜黄素类似物。通过体外细胞毒性实验评价目标化合物对人前列腺癌细胞和人皮脂腺细胞的抑制作用，分析构效关系；对前列腺癌细胞毒性较好的化合物进一步研究其对AR蛋白表达的抑制作用；最后通过分子对接模拟研究其与AR蛋白的结合亲和力和结合模式。研究得出，多个化合物对22Rv1细胞的细胞毒性优于或类似于DMC；A2、A3、B1–B3、D1、F1、F3、G1、G3、H1和P3对前列腺癌细胞选择性高于DMC；O1–O3、A1–A3、B1–B3、F1、F3、G1、I1和P3对AR阴性PC-3细胞毒性低于22Rv1细胞。AR抑制实验中，O1–O3、A1–A3、I1对AR-FL和AR-V7的抑制与DMC相似，P3对AR-FL抑制显著增强；B2、B3、F1、F3抑制作用降低，B1和G1几乎无显著AR抑制。分子对接证实O1–O3、A1–A3、I1和P3对AR具有高靶向能力。A2、A3和P3具有高抑制活性和选择性，是靶向AR-FL和AR-V7的CRPC药物发现候选物，具有重要意义。

关键技术方法：以乙酰丙酮为起始物，经烷基化引入R₁，再经硼催化双醛缩合引入R₂合成目标物；采用¹H NMR、¹³C NMR、高分辨质谱（HRMS）和高效液相色谱（HPLC）表征。用MTT法测定22Rv1（AR阳性前列腺癌细胞）、PC-3（AR阴性前列腺癌细胞）和SZ95（人皮脂腺细胞）的半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）。用Western blot检测22Rv1细胞中AR-FL和AR-V7表达，β-actin为内参。分子对接使用Discovery Studio的CDOCKER算法，靶蛋白为PDB ID: 3ZQT，并用NDGA重对接验证，RMSD为1.62 ?；GraphPad进行单因素方差分析。细胞株为人源细胞系，无样本队列来源。

研究结果部分，合成与表征方面，研究人员从乙酰丙酮出发，经烷基化引入中心烷基R₁，再经硼催化双醛缩合在两端引入芳基R₂，合成姜黄素类似物。取代乙酰丙酮先与硼氧化物形成硼络合物，加入取代苯甲醛和正丁胺后缩合，再经稀乙酸加热裂解硼络合物得到终产物。NMR和HRMS结果确认所有化合物成功制备，HPLC测定纯度。体外细胞毒性评价方面，MTT实验显示，与DMC相比，A1–A3、B1–B3、D1、F1、F3、G1–G3、H1、I1、M1和P3对22Rv1细胞毒性显著改善；C1、C3、F2、H2、H3、I2、J1、J3、M3、O1、O2和O3对22Rv1细胞毒性略增强或相似；其他化合物毒性降低。SZ95细胞毒性结果显示，A2、A3、B1–B3、D1、F1、F3、G1、G3、H1和P3对前列腺癌细胞选择性高于DMC。PC-3细胞毒性结果显示，所有测试化合物对PC-3细胞毒性均低于对22Rv1细胞，提示这些化合物通过靶向AR对22Rv1细胞发挥强细胞毒性。构效关系分析方面，β-二酮部分R₁对活性影响显著，改变R₁空间位阻和亲脂性可导致IC₅₀差异，但未建立明确通用趋势以偏好特定R₁修饰；原文认为R₁可能作为AR配体结合口袋内的中等空间调节基团。苯环R₂对活性影响剧烈，活性大致排序为：4-acetamido、4-methanesulfonyl > 3-fluoro、3,4-difluoro > 2-fluoro-4-methoxy、3,4-dimethoxy > 4-fluoro-3-methoxy、2,3,4-trifluoro、2-fluoro、4-fluoro、2,4-difluoro、2-trifluoromethyl、3-trifluoromethyl。对位吸电子基团（4-acetamido、4-methanesulfonyl）类似物活性最强，提示芳香骨架与AR结合腔存在有利电子相互作用；多氟取代通常保留中等活性，邻位三氟甲基取代抑制作用较弱，可能因空间位阻破坏配体口袋内最佳π堆积；甲氧基取代衍生物活性中等，说明仅给电子烷氧基不能达到强对位吸电子取代的活性。总体而言，末端R₂取代基的电子效应和空间性质共同决定结合亲和力与细胞活性。AR蛋白抑制实验方面，Western blot显示，O1–O3、A1–A3、F3、I1和P3显著抑制22Rv1细胞中AR-FL和耐药相关蛋白AR-V7表达；B2、B3和F1显著抑制AR-FL但不显著抑制AR-V7；B1和G1几乎无AR抑制效果。O1–O3、A1–A3和I1对AR-FL和AR-V7的抑制与DMC相似；B2、B3、F1和F3较DMC降低；P3对AR-FL抑制显著增强，对AR-V7抑制与DMC相似。分子对接模拟方面，研究人员选择AR晶体结构（PDB code: 3ZQT），其为AR与Nordihydroguaiaretic acid（NDGA）复合物，NDGA为天然多酚AR抑制剂，与姜黄素类似物分子骨架高度相似。重对接NDGA的RMSD为1.62 ?（<2.0 ?），证实对接方法可行。CDOCKER相互作用能显示，A1–A3、B1–B3、O1–O3、G1和I1对AR结合亲和力高于DMC；P3与DMC相似；F1和F3降低。结合AR抑制实验，A1–A3、O1–O3、I1和P3对AR具有强靶向活性。B1–B3对AR结合亲和力高于DMC，但AR降解活性降低，说明化合物与AR配体结合域强结合是启动AR降解的必要但非充分条件；这些衍生物虽可占据配体结合口袋并形成稳定复合物，但未能引发后续泛素化和降解级联所需关键构象重排。结合模式显示，A1与TYR834、PHE673、PRO671、LEU830、ASN833、PRO723、GLU829等残基作用；A2与PHE673、ASN833、ARG840、GLU837等作用；A3与ASN727、ILE672、PRO671、ARG840、PRO723、TYR834、PHE673等作用；I1与MET742、MET787、LEU873、MET780、LEU701、LEU704等作用；O1与ARG840、GLU837、ILE672、LEU830、ASN833、PHE673等作用；O2与GLN670、ARG840、PRO723、ILE672、PHE673、ASN833等作用；O3与GLN829、PRO671、TYR834、LEU830、GLU837、PHE673、ILE672等作用；P3与ASN727、PHE826、PRO723、GLU837、PHE673、GLU829等作用；DMC与ASN727和ARG840作用。上述相互作用包括常规氢键、π-烷基、π-阴离子、π-阳离子、π-硫、卤素（氟）作用、烷基作用和范德华作用等。结果表明，A1–A3、O1–O3、I1和P3与DMC具有不同AR结合模式。

讨论部分总结认为，R₁和R₂取代均显著影响活性，R₂影响更突出；对位吸电子基团、3-氟和3,4-二氟取代有利于提高细胞毒性；AR结合亲和力与AR降解活性并不完全一致，强结合是AR降解的必要但非充分条件。综合细胞毒性、选择性和AR抑制结果，A2、A3和P3表现突出。研究结论部分翻译如下：本研究旨在通过修饰姜黄素的化学结构，设计并合成新型雄激素受体抑制剂以对抗前列腺癌。在合成化合物中，多个化合物对22Rv1细胞的细胞毒性相似或增强于DMC。对SZ95细胞的进一步细胞毒性实验显示，化合物A2、A3、B1–B3、F1、F3、G1和P3对前列腺癌细胞具有优于DMC的选择性。对AR阴性PC-3细胞的细胞毒性实验显示，化合物O1–O3、A1–A3、B1–B3、F1、F3、G1、I1和P3均表现出较低细胞毒性。构效关系分析表明，β-二酮部分的取代基R₁和苯环上的取代基R₂均对合成化合物活性有显著影响，R₂影响更突出。苯环含4-acetamido、4-methanesulfonyl、3-fluoro、3,4-difluoro取代的化合物比其他R₂取代化合物细胞毒性更强。Western blot分析证明，O1–O3、A1–A3和I1对22Rv1细胞的AR-FL和AR-V7抑制作用与DMC相似，而P3对AR-FL抑制显著增强。最后，分子对接模拟研究结合亲和力和结合模式，进一步证实O1–O3、A1–A3、I1和P3对AR具有高靶向能力。在所有合成化合物中，A2、A3和P3表现突出。它们不仅对AR具有高结合亲和力，还强效抑制全长AR和剪接变异体AR-V7。此外，这些化合物对去势抵抗性前列腺癌细胞增殖表现出选择性抑制活性，突出其作为新型CRPC治疗药物开发的有前景先导候选物的巨大潜力。