黄曲霉毒素B1（AFB1）加重长期生酮饮食（KD）诱导的小鼠肝脏氧化应激、炎症及糖脂代谢紊乱

《Food Frontiers》：Aflatoxin B1 Exacerbates Ketogenic Diet-Induced Hepatic Oxidative Stress and Glucose and Lipid Metabolic Disturbances in Mice

　　

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）是一种广泛存在的霉菌毒素，具有严重肝毒性。尽管生酮饮食（KD）日益被采用，但长期KD喂养可诱导肝脏代谢紊乱。然而，KD条件下AFB₁暴露的影响仍不清楚。研究人员假设长期KD诱导的代谢应激增加肝脏对AFB₁毒性的易感性，从而加重肝损伤。在本研究中，研究人员研究了AFB₁对喂食KD 10周小鼠肝损伤的影响。结果表明，与AFB₁和KD组相比，KD+AFB₁共暴露使血清ALT（丙氨酸氨基转移酶）水平分别显著增加108.21%和29.85%（均p < 0.01），AST（天冬氨酸氨基转移酶）水平分别增加35.57%（p < 0.01）和25.31%（p < 0.05）。共暴露还加重肝脏脂质积累，TG（甘油三酯）、T-CHO（总胆固醇）、LDLC（低密度脂蛋白胆固醇）和NEFA（非酯化脂肪酸）水平升高（均p < 0.01），HDLC（高密度脂蛋白胆固醇）水平降低（p < 0.01）。油红O染色和TEM（透射电子显微镜）进一步证实明显的肝脏脂质积累和超微结构损伤。共暴露还增加氧化应激，表现为ROS（活性氧）（分别增加34.23%和24.77%）和MDA（丙二醛）水平（分别增加14.96%和2.14%）升高，并增强肝脏炎症，TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-6（白细胞介素-6）和COX-2（环氧合酶-2）增加，IL-10（白细胞介素-10）水平降低。非靶向代谢组学揭示明显的肝脏代谢紊乱，尤其是甘油磷脂、脂肪酸、谷胱甘肽和TCA（三羧酸）循环代谢。蛋白表达分析进一步支持这些代谢改变，显示KD+AFB₁共暴露后p-AMPK（磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶）受抑制，mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）磷酸化增加，PPAR-γ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）表达上调。总之，AFB₁加重长期KD相关的肝脏氧化应激、炎症以及糖脂代谢紊乱。这些发现强调长期KD诱导的代谢紊乱期间的膳食安全。

研究背景与问题：生酮饮食（ketogenic diet, KD）是一种高脂、极低碳水化合物的饮食模式，最初用于难治性癫痫，现广泛用于多种代谢紊乱管理。早期KD适应可诱导生理性酮症并促进代谢重编程，但长期KD暴露可使肝脏从适应性生理转向慢性代谢应激，诱导肝脂肪变性、脂毒性、线粒体功能障碍、慢性炎症和全身糖脂代谢失衡。黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁, AFB₁）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的常见霉菌毒素，可污染谷物、坚果和香料等农产品。AFB₁经细胞色素P450（cytochrome P450, CYP450）酶系统代谢活化生成AFB₁-8,9-环氧化物（AFB₁-8,9-epoxide, AFBO），引起氧化应激、线粒体功能障碍、炎症和糖脂代谢紊乱。然而，KD条件下AFB₁暴露是否进一步破坏肝脏代谢稳态并加重肝损伤尚不清楚。基于长期KD增加肝脏脂肪酸利用、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生和抗氧化需求，研究人员假设长期KD诱导的代谢应激增加肝脏对慢性AFB₁暴露的易感性。

研究开展、结论与意义：研究人员建立C57BL/6J小鼠慢性AFB₁暴露模型，评估KD条件下肝脏代谢和肝损伤，并将非靶向代谢组学与组织病理、生化和分子分析整合。结论表明，AFB₁加重长期KD相关的肝脏氧化应激、炎症以及糖脂代谢紊乱，并伴随腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPAR-γ）信号及关键代谢通路改变。该研究强调在长期KD诱导的代谢紊乱条件下，霉菌毒素暴露相关的膳食安全重要性。

关键技术方法：48只雄性C57BL/6J小鼠（5–6周龄，20–22 g，山东朋悦实验动物科技有限公司，中国）随机分为CON、AFB₁（1.5 mg/L饮水）、KD和KD+AFB₁组，KD组经1周过渡，干预10周。关键技术包括血清和肝脏生化指标、氧化应激标志物和炎症细胞因子测定；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, H&E）、油红O和TEM（transmission electron microscopy, 透射电子显微镜）观察组织病理和超微结构；蛋白质印迹（Western blot）检测代谢相关蛋白；超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS）非靶向代谢组学，结合正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）、变量投影重要性（variable importance in projection, VIP）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析；GraphPad Prism 10统计。

研究结果：

3.1 KD和AFB₁对小鼠肝脏指数、肝功能及肝脏组织病理学的影响：通过体重、肝重、肝脏指数（liver index，肝重/体重×100%）、血清ALT和AST、大体观察及H&E。AFB₁、KD和KD+AFB₁组体重增长低于CON组；KD+AFB₁组肝重和肝指数降低；ALT在KD和KD+AFB₁组升高，KD+AFB₁较KD进一步升高；AST在KD+AFB₁较CON升高。大体和组织病理显示KD+AFB₁最严重，表现为肝小叶结构破坏、微泡和大泡性脂肪变性、炎症细胞浸润和局灶坏死。结论：KD和AFB₁损害生长和肝功能，联合加重肝损伤。

3.2 KD和AFB₁对小鼠糖脂代谢的影响：通过血清和肝脏代谢参数。KD和KD+AFB₁组血清NEFA、β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate, BHBA）、T-CHO和TG升高，GLU降低；肝脏LDLC升高、HDLC降低；KD+AFB₁较KD进一步增加NEFA、T-CHO、TG和LDLC，进一步降低GLU和HDLC。结论：共暴露加重糖脂代谢紊乱。

3.3 AFB₁和KD对肝脏脂质积累和超微结构改变的影响：通过油红O染色和TEM。CON和AFB₁组脂质积累较低，KD组脂滴明显增加，KD+AFB₁组最显著，提示严重肝脂肪变性。TEM显示CON组亚细胞结构正常；AFB₁组轻度线粒体肿胀、核轮廓不规则和少量脂滴；KD组大量大小较一致脂滴，线粒体和核结构基本保留；KD+AFB₁组大量脂滴、严重染色质浓缩和核膜破坏。结论：共暴露加重肝脏脂质积累和超微结构损伤。

3.4 AFB₁加重KD诱导的小鼠肝脏氧化应激和炎症反应：通过检测ROS、MDA、CAT、SOD、GSH以及COX-2、TNF-α、IL-6、IL-18和IL-10。KD+AFB₁组ROS和MDA较CON升高，CAT、SOD和GSH降低；SOD和CAT较AFB₁和KD组进一步降低，SOD/CAT比值由CON组3.11升至KD+AFB₁组4.81。AFB₁和KD组COX-2、TNF-α、IL-6和IL-18升高，IL-10降低；KD+AFB₁进一步加重这些炎症改变。结论：AFB₁加重KD小鼠肝脏氧化应激和炎症。

3.5 小鼠肝脏代谢物的多变量和层次聚类分析：通过非靶向代谢组学。OPLS-DA显示CON、AFB₁、KD和KD+AFB₁组分离，KD+AFB₁距CON最远，模型稳定并通过置换验证。按VIP > 1和p < 0.05共鉴定1629个差异代谢物，其中AFB₁ vs CON为139个，KD vs CON为734个，KD+AFB₁ vs CON为756个。层次聚类显示AFB₁主要影响有机酸和氨基酸代谢，KD主要改变脂质代谢；KD+AFB₁组甘油磷脂、脂肪酰和氨基酸通路代谢物下调。结论：支持肝脏代谢改变。

3.6 差异代谢物的代谢通路富集分析：通过KEGG富集。AFB₁组主要富集叶酸介导的一碳代谢、叶酸代谢、氨基酸和脂质代谢及PPAR信号通路；KD组主要富集缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、癌症胆碱代谢、ABC转运体、精氨酸和脯氨酸代谢及胆汁分泌；KD+AFB₁组广泛富集脂质代谢、氨基酸生物合成和代谢、ABC转运体及碳水化合物代谢。结论：共暴露较单独处理更广泛破坏肝脏能量和营养代谢。

3.7 共享差异代谢物鉴定和代谢通路富集：通过Venn图，AFB₁ vs CON有48个、KD vs CON有262个、KD+AFB₁ vs CON有273个差异代谢物，KD+AFB₁组最多；三个比较共享17个差异代谢物，KD+AFB₁组独有73个。17个共享代谢物分为有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子，共暴露进一步增强其改变。73个独有代谢物包括甘油磷脂（磷脂酰胆碱PC和溶血磷脂酰胆碱LysoPC）、长链脂肪酸、支链氨基酸及其衍生物，主要富集于亚油酸和甘油磷脂代谢、PPAR信号、氨基酸代谢和ABC转运途径。结论：17个共享代谢物可能作为候选代谢生物标志物，73个独有代谢物提示联合暴露特异改变。

3.8 KD和AFB₁共暴露加重肝脏代谢失调：通过Western blot。与AFB₁组比，KD+AFB₁组AMPK和ACC-1表达降低，GLUT2表达升高；与CON组比，KD和KD+AFB₁组PPAR-γ表达升高，KD+AFB₁组PGC-1表达显著降低；KD和KD+AFB₁组p-mTOR/mTOR比值升高。结论：支持代谢组学结果，共暴露加重肝脏代谢紊乱。

讨论部分总结：讨论指出体重增长下降与既往长期KD和慢性AFB₁暴露结果一致；KD和AFB₁均导致肝损伤，共暴露更明显。KD增加BHBA和NEFA，伴TG和肝脏LDLC升高、GLU和肝脏HDLC降低；AFB₁经CYP450生成AFBO，促进GSH耗竭、ROS生成和氧化损伤。共暴露增加ROS和MDA，降低SOD、CAT和GSH，升高SOD/CAT比值，并增加COX-2、TNF-α、IL-6，降低IL-10。代谢组学显示KD+AFB₁组有73个独有差异代谢物，通路涉及脂质代谢、氨基酸代谢、ABC转运体和碳水化合物代谢；甘油磷脂PC和LysoPC及长链脂肪酸改变与TG、NEFA升高和肝脏脂质积累一致；还涉及丙酮酸代谢、GSH和一碳代谢及琥珀酸。蛋白水平显示AMPK信号受抑制，PGC-1α和ACC1降低，PPAR-γ和mTOR信号上调。局限性包括仅使用雄性小鼠，未通过靶向代谢组学进一步验证代表性差异代谢物。

研究结论部分翻译：总之，本研究证明AFB₁暴露进一步加重KD相关的小鼠肝脏氧化应激、炎症及糖脂代谢紊乱。这些效应伴随AMPK、mTOR和PPAR-γ信号及关键代谢通路的改变。这些发现强调在代谢紊乱条件下霉菌毒素暴露相关的膳食安全重要性。然而，未来研究应纳入两性、通过靶向代谢组学验证关键代谢物，并阐明潜在机制。