《Chemical Biology & Drug Design》：DNAzymes and Oligodeoxyribonucleotides Immobilized on Aminopropylsilanol and Polylysine-Anatase Nanoparticles as Active Agents Against Influenza A/H5N1 Virus
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基于氨基丙基硅醇（Si~NH?）和聚赖氨酸-锐钛矿（Ans/PL）纳米颗粒并负载DNA酶（Dz）和寡脱氧核糖核苷酸（ON）的纳米复合物，能够在细胞培养中有效抑制A/H5N1流感病毒的复制。基于两种纳米颗粒的纳米复合物均表现出高活性。含Dz的纳米复
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基于氨基丙基硅醇（Si~NH?）和聚赖氨酸-锐钛矿（Ans/PL）纳米颗粒并负载DNA酶（Dz）和寡脱氧核糖核苷酸（ON）的纳米复合物，能够在细胞培养中有效抑制A/H5N1流感病毒的复制。基于两种纳米颗粒的纳米复合物均表现出高活性。含Dz的纳米复合物比含ON的纳米复合物表现出更高的抗病毒活性，分别将A/H5N1流感病毒的产量降低3.5个对数（log）与2.4–3.0个对数（log）。值得注意的是，掺入纳米颗粒中的Dz效果比用脂质体（lipofectamine）转染的未结合Dz高出一个数量级。携带对流感A病毒基因组不具有特异性的对照DNA片段的纳米复合物几乎没有抗病毒活性，表明所提出的纳米复合物具有特异性。研究证明，纳米复合物的抗病毒功效主要取决于递送入细胞内的DNA的活性，该活性可通过改变纳米复合物浓度或其DNA片段负载容量来调节。所有提出的纳米复合物均可被视为潜在抗病毒药物。
论文解读文章
一、研究背景与意义
核酸（NA）片段，包括RNA和DNA片段及其类似物、DNA酶（DNAzyme，Dz）、RNA酶、适配体、小干扰RNA（siRNA）等，常被用于开发针对细胞内基因组进行有效和选择性作用的方法。核酸片段能够识别特定基因的mRNA序列，阻断其功能，从而抑制导致各种遗传病、病毒性疾病和肿瘤疾病的非期望基因的表达。这些治疗制剂应在副作用最小的前提下尽可能高效。
催化活性核酸——DNA酶（Dz）具有重要研究价值。它们能够形成适配靶RNA的二级结构，并以催化方式切割靶RNA，如同基因特异性分子剪刀。然而，将核酸片段有效递送入细胞是制约其应用的关键瓶颈。利用纳米颗粒作为核酸药物递送载体是一种有前景的策略。二氧化钛（TiO?）纳米颗粒因其穿透质膜的能力、稳定性以及可通过表面修饰固定各种化合物的可能性，被认定为潜在的核酸片段载体。二氧化钛纳米颗粒的细胞毒性在高浓度（超过200 μg/mL）时显现，而在较低浓度下无毒。二氧化硅纳米颗粒作为非病毒核酸纳米载体也展现出良好潜力，其毒性低于广泛使用的转染试剂脂质体（lipofectamine），并能保护核酸片段免受核酸酶降解。
此前，研究人员已证明基于TiO?纳米颗粒的含ON和Dz纳米复合物以及基于氨基丙基硅醇纳米颗粒的含ON纳米复合物能有效抑制流感A病毒（IAV）的复制。然而，基于氨基丙基硅醇纳米颗粒的含Dz纳米复合物的合成及其抗病毒活性尚未见报道。本研究首次合成了基于氨基丙基硅醇纳米颗粒的含Dz纳米复合物，旨在将其对A/H5N1流感病毒的抗病毒活性与此前合成的含Dz或ON制剂进行比较，并筛选出最具潜力的候选制剂。
二、研究内容与主要结论
研究人员选择流感A病毒第5片段作为纳米复合物作用的靶点，因为该片段编码核蛋白（nucleoprotein，NP），核蛋白在将病毒基因组整合入受感染生物体细胞中发挥关键作用，并促进病毒颗粒的复制和组装。研究中使用了“10–23”型Dz，由中央催化片段和与IAV第5片段编码区互补的侧翼序列组成，该Dz在一大批靶向流感病毒基因组不同区域的DNA酶中表现出最高活性。ON?靶向与Dz?相同的区域，ON?靶向IAV第5片段的非编码区。对照DNA片段cON和cDz与IAV基因组不互补。
研究人员利用氨基丙基硅醇（Si~NH?）纳米颗粒和聚赖氨酸包被的锐钛矿型二氧化钛纳米颗粒（Ans/PL）构建携带DNA片段的纳米复合物。Si~NH?•Dz纳米复合物通过Dz的核苷酸间磷酸基团与纳米颗粒氨基基团之间的静电结合制备。与初始纳米颗粒（约1 nm）相比，所得产物的尺寸增大至约3.5 nm，zeta电位从约+9 mV变为约?40 mV，证实纳米复合物的形成。所有纳米复合物均被证明能够穿透真核细胞。
三、关键技术方法
研究人员采用以下主要关键技术方法开展研究：通过(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）水解合成氨基丙基硅醇（Si~NH?）纳米颗粒；通过钛酸四异丙酯水解制备锐钛矿型TiO?纳米颗粒（Ans），并用聚赖氨酸（PL）包被形成Ans/PL；通过静电相互作用将DNA酶（Dz）和寡脱氧核糖核苷酸（ON）固定到纳米颗粒上制备纳米复合物；采用动态光散射（DLS）法测量纳米颗粒的尺寸和zeta电位；利用透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、扫描电子显微镜（SEM）、小角X射线散射（SAXS）、原子力显微镜（AFM）和高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）等物理化学方法表征纳米颗粒和纳米复合物；采用MDCK细胞培养体系评估纳米复合物的半数毒性浓度（TC??）和抗病毒活性；使用Spearman–Karber方法进行病毒滴度统计分析和显著性检验。
四、研究结果
4.1 纳米复合物的制备与表征
Si~NH?•Dz纳米复合物通过静电结合成功制备，尺寸从约1 nm增大至约3.5 nm，zeta电位从约+9 mV变为约?40 mV，证实Dz成功固定到纳米颗粒上。Si~NH?和Si~NH?•ON可在25°C保存至少1个月、4°C保存3个月而不发生尺寸变化，表明无聚集现象。Ans/PL和Ans/PL•ON纳米复合物在水溶液中形成非聚集的小尺寸单分散颗粒（Ans/PL约29 nm，Ans/PL•ON约33 nm），水动力直径和粒径分布至少3个月不变。使用放射性和荧光标记的寡核苷酸证实了寡核苷酸与纳米颗粒的结合，并证明纳米复合物中的寡核苷酸保留了形成互补复合物的能力。
4.2 剂量依赖性抗病毒活性研究
研究人员通过两种方式考察了含ON纳米复合物的剂量依赖性抗病毒活性：一是固定纳米复合物浓度改变ON负载容量，二是固定ON负载容量改变纳米复合物浓度。两种方式均导致纳米复合物中ON浓度（μM）的改变。Ans/PL•ON和Si~NH?•ON的剂量-反应曲线在两种变体下基本重合，表明纳米复合物的抗病毒功效主要取决于递送入细胞的活性DNA的量，可通过改变纳米复合物浓度或其对DNA片段的负载容量来调节。0.1 μM的ON浓度被选为后续研究的最优浓度，因为此时剂量-反应曲线几乎达到平台期，进一步增加ON浓度仅产生极小的额外抗病毒效果。
4.3 细胞毒性评估
Si~NH?•Dz?纳米复合物对MDCK细胞的半数毒性浓度（TC??）超过20 μM（以Dz?计），与此前报道的Si~NH?•ON、Ans/PL•ON和Ans/PL•Dz的TC??值一致。纳米复合物的毒性仅取决于纳米颗粒本身。抗病毒活性评估在无毒浓度（纳米复合物中ON或Dz浓度为0.1 μM）下进行，远低于各自的TC??阈值。
4.4 抗病毒活性比较
携带靶向病毒基因组ON或Dz的纳米复合物对A/H5N1病毒表现出高活性，选择性抑制病毒复制达2.8–3.5个对数（log）。携带非互补对照cDz和cON的纳米复合物几乎无活性。纳米复合物中互补ON和Dz的活性高于在脂质体（lipofectamine）存在下未结合的DNA片段。含Dz的纳米复合物比含ON的纳米复合物活性高约1个对数（log），当Dz?和ON?靶向病毒mRNA的同一区域时尤为明显。与文献报道相比，使用反义ON（4 μM）仅使病毒滴度降低1.0–1.2 log，吗啉代寡核苷酸偶联递送肽在30 μM浓度下抑制效果为2.0 log，而本研究的Si~NH?•Dz和Ans/PL•Dz纳米复合物在显著较低的Dz浓度（0.1 μM）下实现了3.5 log（99.97%）的病毒产量抑制。
五、讨论与结论
研究结果表明，携带靶向A/H5N1流感病毒基因组DNA片段的纳米复合物在体外显著抑制病毒复制达2.8–3.5 log（减少99.83%–99.97%），展现出极高的效力。相反，携带非互补DNA片段的纳米复合物活性可忽略不计，这一鲜明对比证实了所提出纳米复合物的序列特异性作用机制。纳米复合物的抗病毒功效主要取决于递送入细胞的DNA的活性，可通过改变纳米复合物浓度或其DNA片段负载容量来调节。所用浓度远低于TC??值，证明抗病毒效果直接归因于序列特异性抑制作用而非非特异性毒性。选定的Dz分子在脂质体存在下递送入细胞时活性低于掺入纳米颗粒中的同一Dz，表明锐钛矿和氨基丙基硅醇纳米颗粒作为DNA片段递送载体均表现出更优效率。含Dz的纳米复合物使病毒复制减少3.5 log，比含ON的纳米复合物有效0.5–1.0 log，尤其当Dz和ON靶向病毒基因组的同一区域时。所有评估的纳米复合物制剂均为有前景的抗病毒候选药物，可根据合成成本、简便性和特定治疗活性之间的平衡进行选择。
