单细胞多组学与肠道微生物组整合解析乳腺癌进展的细胞轨迹、SNAI1–ZEB1–FOXM1调控网络及肠–乳腺轴失调

《International Journal of Genomics》：Single-Cell Multiomics Integration Reveals Cell Trajectories and Regulatory Networks in Breast Cancer Progression

　　

背景：乳腺癌是一种分子异质性疾病，包含预后和治疗反应不同的亚型。尽管已进行大量批量基因组表征，驱动的乳腺癌从luminal向mesenchymal状态进展的单细胞转录轨迹、染色质调控景观和细胞间通讯网络仍未完全阐明。新兴证据提示肠道微生物组失调（gut microbiome dysbiosis）作为乳腺癌风险、免疫调节和治疗反应的系统性调节因素；然而，尚未将其与高分辨率单细胞图谱协同表征。将单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与染色质可及性分析（single-cell ATAC sequencing, scATAC-seq）、细胞–细胞通讯推断和肠道微生物组16S rRNA分析整合，为解析乳腺癌进展的瘤内调控逻辑和系统性微生物景观提供了全面多层方法。

方法：研究人员对来自GEO数据库（GSE161529）的乳腺癌患者样本中42,037个高质量单细胞进行了整合多组学分析，涵盖肿瘤和邻近正常组织。scRNA-seq数据使用Seurat v4.3.0和Scanpy v1.9.1处理。应用了降维、Leiden聚类、差异表达分析、拟时序轨迹推断（Monocle3、scVelo、Slingshot）、SCENIC regulon分析、染色质可及性分析、细胞–细胞通讯推断（CellChat）和功能富集分析。关键标志基因在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中通过定量RT-PCR（qRT-PCR）验证。同时，对来自599对匹配乳腺癌–健康对照（266个属，四个BioProjects）的肠道微生物组16S rRNA扩增子测序数据，分析了α/β多样性、差异属丰度（Mann–Whitney U检验与Benjamini–Hochberg校正）、属共现网络和随机森林乳腺癌分类。

结果：无偏聚类识别出12个观察到的细胞群体，涵盖luminal（Luminal A、Luminal B）、basal、HER2⁺、癌症相关成纤维细胞（CAF）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、CD8 T细胞、调节性T细胞（Treg）、NK细胞、B细胞、内皮细胞和周细胞区室。质量控制确认数据质量稳健，中位每细胞2400–3100个基因，线粒体含量低于20%。拟时序轨迹分析揭示连续的epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）谱，具有三个分歧谱系：EMT、衰老和免疫激活分支。SCENIC识别出SNAI1(+)、ZEB1(+)和FOXM1(+)为basal/mesenchymal细胞中差异激活最显著的regulon。ATAC-seq染色质可及性分析证实EMT转录因子通过远端增强子进入。CellChat识别出TGF-β1–TGFBR1（CAF → 肿瘤）和PD-L1–PD-1（肿瘤 → CD8 T细胞）为主导细胞间通讯轴。多组学整合将细胞类型分类AUC从0.76（仅scRNA-seq）提高至0.91（完整多组学）。EMT-high肿瘤状态与显著较差的总生存期相关（HR = 2.14，p = 0.001）。qRT-PCR验证证实HER2⁺细胞系中ERBB2富集，basal/TNBC细胞系中KRT5/VIM富集（均p < 0.001）。肠道微生物组分析显示，与健康对照相比，乳腺癌患者存在显著失调，Shannon多样性降低（1.94 vs. 2.06，p = 6.1 × 10^?4），群落水平显著分离（Bray–Curtis PERMANOVA F = 30.2，p = 0.001），以及9个差异丰度属，包括富集的Faecalitalea（log₂FC = 1.44）、Parasutterella（log₂FC = 1.21）和Bacteroides（log₂FC = 1.19）。随机森林微生物组分类器达到交叉验证AUC为0.79（95% CI：0.74–0.82），支持肠–乳腺轴作为癌症状态的系统性共同决定因素。

结论：该整合单细胞多组学与肠道微生物组图谱描绘了驱动细胞轨迹多样化的转录调控架构，突出SNAI1–ZEB1–FOXM1共调控网络作为候选治疗靶点，提示多组学整合可增强具有临床预后相关性的乳腺癌亚型分子分层，并识别肠道微生物组失调——以微生物多样性丢失和特定属富集为特征——作为乳腺癌病理生物学的系统性维度，值得与瘤内分子图谱整合。

论文解读：单细胞多组学与肠道微生物组整合解析乳腺癌进展的细胞轨迹、调控网络及肠–乳腺轴失调

乳腺癌是全球女性中最常诊断的癌症，约占女性癌症病例的30%，年死亡超过670,000例。临床上依据激素受体状态（雌激素受体[ER]；孕激素受体[PR]）和HER2扩增进行分子亚型分类，形成Luminal A、Luminal B、HER2富集型和三阴性乳腺癌（TNBC）等亚型。然而，这些分类不能充分捕捉由不同细胞群体、转录程序、增殖动态和功能状态造成的瘤内异质性，而这些异质性共同影响肿瘤进展、治疗抵抗和患者结局。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在单细胞分辨率解析肿瘤异质性，但多数乳腺癌scRNA-seq研究聚焦于单一分析维度，缺乏同时捕捉转录程序、染色质调控可及性、发育轨迹和细胞间通讯网络的整合多组学框架。与此同时，肠道微生物组可通过肠–乳腺轴系统影响乳腺癌风险、免疫稳态、雌激素代谢和治疗反应，但其尚未与同期单细胞瘤内图谱系统关联。因此，研究人员开展整合单细胞多组学和肠道微生物组分析，以解析乳腺癌进展的瘤内调控逻辑和系统性微生物景观。

研究人员分析GEO数据集GSE161529中42,037个高质量单细胞，涵盖肿瘤和邻近正常组织；并结合公共scATAC-seq数据、TCGA-BRCA批量转录组、MCF-7与MDA-MB-231细胞系qRT-PCR验证，以及来自SRA四个BioProjects（PRJNA658160、PRJNA383849、PRJNA872152、PRJNA634145）的599对匹配乳腺癌–健康对照肠道微生物组16S rRNA数据。关键技术方法包括：Seurat v4.3.0与Scanpy v1.9.1进行质控、标准化、降维、Leiden聚类、差异表达和标志基因注释；Monocle3、scVelo、Slingshot和PAGA进行拟时序、RNA velocity和分支轨迹推断；pySCENIC推断regulon；GSE243526 scATAC片段进行染色质可及性、HOMER motif和Seurat WNN跨模态整合；CellChat推断配体–受体通讯；clusterProfiler与fgsea进行功能富集；随机森林、PERMANOVA、Mann–Whitney U与Benjamini–Hochberg校正分析微生物组；并在MCF-7和MDA-MB-231中行qRT-PCR验证。

3.1 单细胞转录组图谱识别乳腺癌中12个不同细胞群体。研究人员通过Leiden聚类得到12个细胞群，注释为Luminal A、Luminal B、basal、HER2⁺、CAF、TAM、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、B细胞、内皮细胞和周细胞，并确认肿瘤与正常来源是主要转录分离轴。

3.2 差异表达分析定义各细胞群体的分子特征。Wilcoxon秩和检验显示ERBB2限于HER2⁺群，ESR1/PGR共标记Luminal A，KRT5/CDH1区分basal与luminal，VIM在CAF和basal中最高；Luminal B和basal增殖活性升高，basal中VIM、SNAI1、MMP2上调而CDH1、ESR1下调。

3.3 拟时序轨迹重建揭示EMT为连续多谱系连续体。Monocle3、RNA velocity、Slingshot和PAGA分析显示从Luminal A根状态向basal/mesenchymal状态的连续轨迹，CDH1/EPCAM下降而VIM、SNAI1、MMP2升高；识别出EMT、衰老和免疫激活三个分歧谱系，MKI67和FOXM1为EMT–衰老分支点相关基因。

3.4 SCENIC regulon分析与染色质可及性分析定义EMT转录调控架构。SNAI1(+)、ZEB1(+)和FOXM1(+)在basal/mesenchymal中差异活性最高，SNAI1(+)调控48个下游EMT效应因子；scATAC显示SNAI1和ZEB1主要通过远端增强子进入靶调控元件，HOMER富集SNAI1-motif、ZEB1-motif和AP-1；SNAI1与ZEB1正相关（r = 0.83），SNAI1与CDH1负相关（r = ?0.71）；GSEA显示EMT、MYC targets和G₂M checkpoint在basal/mesenchymal中上调。

3.5 CellChat揭示TGF-β和免疫检查点信号为主要细胞间通讯轴。CAF和TAM是主要发送者，肿瘤上皮是主要接收者；TGF-β1–TGFBR1（CAF → 肿瘤）和PD-L1–PD-1（肿瘤 → CD8 T细胞）为最强通讯轴；TGF-β通路在basal/TNBC微环境中更强；Treg通过CTLA-4–CD80和LAG-3–MHC-II与CD8 T细胞通讯，构成免疫抑制回路。

3.6 多组学整合显著增强细胞分类并揭示跨模态调控模块。联合RNA–ATAC嵌入改善细胞类型分离，RNA表达与ATAC可及性正相关（r = 0.71）；识别出五个跨模态调控模块：EMT/mesenchymal（38%）、luminal differentiation（29%）、proliferation（22%）、immune regulation（18%）和cross-omics hub（12%）；分类AUC从仅scRNA-seq的0.76提高至完整多组学的0.91。

3.7 EMT调控特征预测较差预后并分层治疗反应。TCGA-BRCA中EMT-high组总生存期较差（中位OS：32.1 vs. 56.8个月；HR = 2.14，95% CI：1.47–3.11，p = 0.001），校正年龄、分期和亚型后仍为独立预后因素（校正HR = 1.89，p = 0.003）；Top 10 EMT调控基因可区分四种分子亚型；GDSC2分析预测紫杉醇和他莫昔芬响应概率最高，olaparib和atezolizumab对BRCA1缺陷TNBC预测有效。

3.8 代谢、免疫检查点和空间结构的综合多模态分析。basal/TNBC细胞糖酵解（LDHA、PKM2）和ROS生成程序升高，luminal细胞偏好氧化磷酸化和脂肪酸代谢；PD-1在CD8 T细胞最高，PD-L1在肿瘤细胞和TAM高表达，CTLA-4和LAG-3在Treg升高；空间转录组计算推断显示免疫细胞富集于肿瘤–基质界面，CD8 T细胞从肿瘤核心排除。

3.9 定量RT-PCR验证关键亚型特异性标志基因。MCF-7中ERBB2、ESR1、PGR和CDH1表达显著高于MDA-MB-231，而MDA-MB-231中KRT5和VIM显著富集（均p < 0.001），与scRNA-seq结果一致。

3.10 乳腺癌中的肠道微生物组失调。599对匹配样本分析显示，乳腺癌患者Shannon多样性降低（1.94 vs. 2.06，p = 6.1 × 10^?4），Simpson多样性降低（0.73 vs. 0.75，p = 0.041），Bray–Curtis PCoA显示群落分离（PERMANOVA F = 30.2，R² = 0.025，p = 0.001）；9个属显著改变，Faecalitalea、Parasutterella、Bacteroides富集，Romboutsia和Catenibacterium耗竭；随机森林OOB误差率26.5%。

3.11 微生物生物标志物发现与宿主因素关联。随机森林分类器交叉验证AUC为0.79（95% CI：0.74–0.82），Bacteroides为最具判别力属之一；LEfSe确认9个属具有显著LDA效应值；乳腺癌组共现网络包含40个丰度较高属之间的159对相关；女性亚组一致显示失调；年龄与Shannon多样性无显著相关，但乳腺癌患者观察属丰富度显著降低（p = 8.7 × 10^?11）；微生物分类器与单细胞多组学分类器（AUC = 0.91）互补。

讨论部分总结：研究人员将关键发现归纳为12个细胞群体、三条分歧轨迹、SNAI1(+)/ZEB1(+)/FOXM1(+)主导EMT、TGF-β与PD-L1–PD-1主导通讯、多组学整合提高分类、SNAI1–ZEB1 EMT特征具有预后意义，以及肠道微生物组显著失调。讨论指出，三分歧谱系超越既往二元luminal–basal开关模型；FOXM1和MKI67位于EMT–衰老分支点，提示其可能作为命运调控候选靶点。SNAI1与ZEB1通过远端增强子发挥作用，提示BET bromodomain抑制剂可能干扰增强子相关共激活，SNAI1–ZEB1双重靶向可能形成合成脆弱性。TGF-β（CAF → 肿瘤）轴在basal/TNBC中更强，支持亚型分层抗TGF-β治疗，并与PD-L1–PD-1、CTLA-4–CD80轴共同支持TGF-β抑制联合检查点阻断。多组学整合的AUC提高和五个跨模态模块说明EMT不仅是转录程序，也涉及表观基因组重编程。肠道微生物组中丁酸产生属耗竭可能削弱短链脂肪酸介导的免疫调节，Bacteroides富集可能通过LPS–NF-κB影响系统性炎症和PD-L1上调，Faecalitalea和Parasutterella富集可能改变胆汁酸解结合和类固醇激素代谢，影响estrobolome和ER⁺ luminal亚型的雌激素生物利用度；微生物分类器AUC = 0.79提示其具有独立诊断信号，并可能补充单细胞EMT regulon评分。

研究结论翻译：通过对乳腺癌进行全面的整合单细胞多组学与肠道微生物组分析，本研究构建了控制乳腺癌进展的瘤内调控网络和系统性微生物景观的高分辨率双轴图谱。在瘤内水平，研究人员识别出12个观察到的细胞群体，从共同luminal祖细胞重建出三条分歧轨迹谱系，并提名通过远端增强子发挥作用的SNAI1–ZEB1–FOXM1共调控网络作为EMT介导进展的主要驱动因素。TGF-β（CAF → 肿瘤）和PD-L1–PD-1（肿瘤 → CD8 T细胞）成为免疫抑制性乳腺癌微环境（TME）的主要细胞间通讯轴。多组学整合显著增强细胞类型分类，并揭示连接表观基因组与转录程序的跨模态调控模块。SNAI1–ZEB1 EMT regulon特征在TCGA-BRCA中独立预测较差总生存期，提供一个需要进一步验证的候选预后生物标志物。在系统性水平，肠道微生物组分析识别出乳腺癌患者显著失调，特征为α多样性降低、群落水平组成重组、促炎和激素代谢属富集、丁酸产生属耗竭，以及微生物分类器达到AUC = 0.79——这些发现提示肠–乳腺轴失调是免疫抑制性和EMT许可性TME的系统性共同决定因素。总之，这些发现为乳腺癌中EMT靶向、微环境重编程、检查点–TGF-β联合及微生物组信息指导的治疗策略提供了多层次调控和微生物框架。