《Microchemical Journal》：A magnetically enriched suspended liquid membrane-assisted SERS biosensing platform for ultrasensitive detection of
Escherichia coli as a model bacterium
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•开发了一种悬浮液膜辅助SERS生物传感平台，用于超灵敏大肠杆菌检测。•双识别"磁性微球–大肠杆菌–SERS标签"复合物实现了大肠杆菌的特异性捕获和信号放大。•在优化条件下，实现了10 CFU/mL的检测限。•该SERS平台能够实现对复杂基质中大肠杆菌的良好检测。引言致病性细
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开发了一种悬浮液膜辅助SERS生物传感平台，用于超灵敏大肠杆菌检测。
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双识别"磁性微球–大肠杆菌–SERS标签"复合物实现了大肠杆菌的特异性捕获和信号放大。
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在优化条件下，实现了10 CFU/mL的检测限。
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该SERS平台能够实现对复杂基质中大肠杆菌的良好检测。
引言
致病性细菌感染仍是全球公共卫生的主要威胁，其发病率高、传播迅速且临床后果严重。2021年，细菌感染估计导致全球约471万人死亡[1]，且这一负担在未来几十年预计将大幅增加[2]。因此，快速准确地鉴定病原菌对于及时的临床干预、合理抗菌药物使用以及有效控制传染病传播至关重要。
目前，细菌培养仍是病原体鉴定的金标准，因其可靠性高且能提供菌株水平信息。然而，该方法通常需要2–3天或更长时间（取决于细菌种类），这极大限制了其在紧急临床情境和公共卫生应急事件中的应用[3]、[4]、[5]、[6]。为缩短诊断周转时间，已开发出多种替代方法，包括实时聚合酶链反应（RT-PCR）及其他核酸扩增检测、质谱法、比色法和侧向流动检测、流式细胞术以及酶联免疫吸附测定（ELISA）[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。与此同时，基于光学、电化学、微流控、适配体、抗体或噬菌体介导识别的细菌生物传感平台也得到广泛研究，因其可支持微型化、高灵敏度及潜在即时检测分析[14]。然而，核酸检测方法可能受抑制物影响，且不一定能区分活菌和死菌；质谱鉴定通常需要预先培养或足够的生物量；免疫分析依赖于高质量识别试剂且可能存在交叉反应；许多光学或电化学生物传感器仍需样品预处理、富集、校准或受控传感界面以在复杂基质中保持重复性[15]、[16]、[17]。因此，在复杂生物学和食品相关样品中敏感、可重复且相对快速地检测低丰度细菌仍然具有挑战性。
表面增强拉曼散射（SERS）技术因能以高灵敏度和多重检测能力提供分子指纹信息而在生物医学分析领域受到广泛关注[18]。尽管其已在外泌体和组织基础癌症研究中得到验证[19]、[20]，但与本研究更相关的进展是SERS细菌传感策略的发展[21]。现有研究已将SERS与磁性富集、抗体或适配体识别、小分子配体及孢子生物标志物相结合，以提高细菌捕获和信号读出效率。例如，链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子经抗体功能化并包覆银纳米粒子后，已用于细菌的SERS检测[22]。通过靶向二吡啶甲酸钙（CaDPA），也已实现了枯草芽孢杆菌孢子的SERS检测，可在人为加样的新鲜奶样中从低至1×103孢子/mL的浓度进行检测[23]。此外，标记适配体传感策略已实现了混合鼠伤寒沙门氏菌的定量SERS检测[24]。尽管取得了这些进展，传统的液滴沉积SERS受到咖啡环效应的严重影响，导致信号稳定性差且重复性低[25]。原位液相拉曼检测对于溶液中或生理环境中低丰度靶标的超灵敏分析仍然受限[26]。
近年来，三维自由悬挂膜（3D-FSM）平台已在多种SERS应用中得到探索，包括可重复的SERS传感、诺氟沙星等环境污染物测定以及用于淡水急性毒性监测的微生物传感[27]、[28]、[29]。这些研究表明了基于3D-FSM的液相界面在提高SERS测量性能和拓展分析应用方面的潜力。尽管取得了这些进展，但大多数已报道的3D-FSM辅助SERS策略主要关注小分子检测或通用信号重复性改善。其用于完整细菌检测的应用，尤其是与磁性捕获、双分子识别和细菌相关SERS复合物的定向富集相结合，仍有待充分探索。
为解决传统SERS细菌检测方法灵敏度和重复性有限的问题，我们开发了一种磁性双识别悬浮液膜（SLM）辅助SERS平台，用于低浓度大肠杆菌（E. coli）分析。在这项概念验证研究中，采用非致病性大肠杆菌BW25113作为模式菌，并使用预处理后加样的基质来界定研究的分析范围。该平台集成了小麦胚芽凝集素（WGA）修饰的磁性微球用于细菌捕获，以及适配体功能化的Au@4-巯基苯甲酸（MBA）@Ag核壳SERS标签用于目标识别和信号产生。所得的磁性微球–细菌–SERS标签复合物在外部磁场作用下进一步在SLM内浓缩，从而增加局部热点密度并提高信号强度和稳定性。在优化条件下，该平台实现了最低实验验证可检测浓度1×101菌落形成单位/毫升（CFU/mL），与非富集系统相比SERS信号增强8–10倍，并在1×103–1×10? CFU/mL范围内呈定量线性响应。利用预处理的人精浆（HSP）、人尿液及商业果汁加样102 CFU/mL 大肠杆菌进行了初步低浓度可行性评估，显示总体技术变异可控。此外，在HSP、真实人尿液及商业果汁中进行了基质匹配的多种水平加样回收实验，以进一步评估预处理和加样条件下的分析响应和基质相容性。这些实验旨在作为概念验证的基质评估，而非在自然感染临床标本或自然污染食品样本中进行验证。
章节摘录
试剂与仪器
主要试剂：氯金酸（HAuCl?·4H?O）、柠檬酸三钠（Na?C?H?O?）、抗坏血酸（AA）、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）和氯化钠（NaCl）购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。硝酸银（AgNO?）购自国药化学试剂有限公司（中国）。牛血清白蛋白（BSA）购自上海生工生物工程技术服务有限公司（中国）。磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M，pH 7.4）购自
用于大肠杆菌检测的磁性富集SLM辅助SERS生物传感器的设计与工作原理
图1展示了用于大肠杆菌检测的SLM辅助磁性SERS生物传感平台的工作流程。WGA修饰的Fe?O?@COOH磁性微球用于细菌捕获（图1a），而适配体功能化的Au@MBA@Ag纳米颗粒作为SERS标签用于目标识别和信号产生（图1b）。如图1c所示，大肠杆菌细胞首先被WGA修饰的磁性微球捕获，然后与适配体功能化的SERS标签标记，形成磁性
结论
在本研究中，我们开发了一种SLM辅助SERS生物传感平台，集磁性富集于一体，并以非致病性大肠杆菌作为模式菌，探索了在预处理和加样的复杂基质背景下灵敏检测大肠杆菌的可行性。Fe?O?@COOH@WGA缀合物表现出高效的细菌捕获能力，捕获效率高达87.8%。与巯基化适配体功能化的Au@MBA@Ag核壳纳米颗粒联合，共孵育与
CRediT作者贡献声明
朱明杭：撰写 – 初稿，方法论，概念设计。施佳欣：软件，数据整理。黄静：软件，调查。张发胜：可视化。高宇博：调查。陈帅：验证。杜盛荣：监督。黄祖方：撰写 – 审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所述工作。
致谢
本研究受国家自然科学基金（62275049）和福建省科技创面联合基金（2023Y9383）资助。
朱明杭|施佳欣|黄静|张发胜|高宇博|陈帅|杜盛荣|黄祖方
