《Microchemical Journal》：Compartmentalized microfluidics with anchored signal release enables matrix-resistant CRISPR detection of emerging contaminants in complex food matrices
编辑推荐：
•锚定信号释放机制实现复杂食品基质中具有基质抗性的基于CRISPR的生物检测。•信号前体在严格洗涤过程中保留在磁珠上，以消除干扰物。•CRISPR-Cas12a的跨切割仅在样品基质完全去除后按需触发。•微流控传感器在食品中对农药啶虫脒的检测限为3.17 nM。•在六种多样化的
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锚定信号释放机制实现复杂食品基质中具有基质抗性的基于CRISPR的生物检测。
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信号前体在严格洗涤过程中保留在磁珠上，以消除干扰物。
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CRISPR-Cas12a的跨切割仅在样品基质完全去除后按需触发。
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微流控传感器在食品中对农药啶虫脒的检测限为3.17 nM。
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在六种多样化的食品相关基质中，基质效应保持微弱（|ME| < 16%）。
引言
新兴污染物（EMCs）——包括农药、内分泌干扰物和药品——因其持久性、迁移性和在农作物及食物链中的生物累积潜力，对食品安全构成了重大挑战[1]。除了其环境影响之外，慢性低剂量暴露还与基因组不稳定性、表观遗传学改变以及慢性病风险增加存在流行病学和毒理学关联[2]。这一双重威胁迫切需要能够对食品产品进行灵敏、准确、现场监测的分析平台。色谱-质谱联用技术仍然是EMCs定量的金标准[3], [4], [5]，但其操作复杂性和缺乏便携性限制了其在快速现场分析中的应用，尤其是在需要实时检测的资源有限场合。
微流控生物传感器在微型化、自动化和便携性方面具有固有优势[6], [7], [8]，能够实现样品处理、反应和检测的集成，并减少试剂消耗和检测时间。然而，在保留现场适用性的同时实现与台式仪器相当的灵敏度仍然是一个重大挑战。近期将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白（Cas）系统整合到生物传感平台中提供了一种潜在解决方案。Cas13和Cas12a等CRISPR效应蛋白表现出可编程的附带核酸切割（跨切割）活性，能够实现显著的信号放大[9], [10], [11]。这一能力通过与功能性DNA（fDNA）元件如适配体相结合得到补充，适配体充当非核酸靶标的分子翻译器[12]。在典型构型中，靶标结合触发预加载DNA激活剂的释放，启动CRISPR-Cas放大，将单次分子识别事件转化为放大读数[13], [14]。微流控技术与基于CRISPR的传感技术的结合，因此代表了现场可部署的高灵敏度食品安全生物传感器的一个有前景的方向[15]。
尽管具有这种潜力，基于CRISPR的生物传感器从实验室环境向复杂现实环境的应用受到基质干扰的阻碍，基质干扰会抑制Cas酶活性并损害信号保真度[16]。这种脆弱性源于传统检测架构，其中靶标结合事件直接将CRISPR激活剂链释放到样品基质中[17], [18], [19], [20]。因此，释放的激活剂和随后的酶促反应——涉及蛋白质和核酸——都暴露于抑制活性的基质成分中。磁分离策略通常被用于缓解这一问题[21], [22], [23], [24]。将fDNA探针固定化在磁珠上可以在靶标结合后实现探针的物理隔离。然而，这种方法仅提供部分纯化，因为释放的激活剂仍在受污染的超滤液中自由扩散，不可避免地将基质干扰物带入下游扩增步骤。因此，即使采用磁分离，激活剂仍被释放到液相中，并伴随残余基质成分共迁移进入扩增步骤。这凸显了需要对扩增反应与原始样品基质进行物理分离的检测工作流程的必要性——这对于分析复杂食品基质尤其关键。
在此，我们报道了一种具有磁珠锚定信号前体保留和按需释放功能的区室化微流控平台，用于具有基质抗性的基于CRISPR的检测（图1）。组装在链霉亲和素包被磁珠（SAMBs）上的双链DNA（dsDNA）探针包含了靶标特异性适配体（例如啶虫脒结合适配体（ABA）[25], [26]，其识别啶虫脒作为模型EMC[27]）和CRISPR激活剂链（Act）。关键的是，Act通过稳定的硫醇-马来酰亚胺化学[28]共价连接到Strep-tag II上，并且该共价连接的Act-Strep-tag II偶联物通过Strep-tag II/链霉亲和素的高亲和力相互作用（KD ≈ 72 μM [29]）可逆地锚定在SAMBs上。在此设计中，激活剂在靶标识别和严格洗涤过程中保留在固相上，而非像传统磁珠检测那样释放到样品超滤液中。传统超滤液释放架构与锚定保留设计的示意图比较见图S1。这种保留使得基质干扰物可以被去除，而信号前体保持固定；随后，激活剂通过D-去硫生物素竞争（KD ≈ 10?14 M [30]）洗脱到一个物理隔离的检测腔室中。在这个洁净的区室中，纯化的激活剂触发预加载的Cas12a-crRNA复合物，启动跨切割反应，产生不受基质来源抑制的强信号放大的荧光信号。我们证明，这种集成方法能够在多种食品相关基质（蔬菜、水果、水、土壤、蜂蜜和茶）中实现可靠且具有基质抗性的啶虫脒定量分析。
章节摘要
材料、试剂和仪器
材料、试剂和仪器在支持信息（SI）中有描述。
(ABA-act)-(strep-tag II)-SAMBs的制备
将SAMBs涡旋混匀，取100 μL aliquot进行磁分离，用1 mL结合缓冲液（10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）洗涤三次。此处使用的Strep-tag II肽为定制合成，带有末端马来酰亚胺基团（马来酰亚胺修饰的Strep-tag II；上海生工生物），直接使用，未经进一步修饰。预处理后的SAMBs随后与
锚定信号保留和按需释放的探针设计
为了将靶标识别与信号放大解耦，我们设计了一种在可控洗脱前将CRISPR激活剂保留在固相载体上的探针。这种可逆固定化双链DNA（dsDNA）探针的分子设计和工作原理如图2A所示。该探针由啶虫脒特异性结合适配体（ABA）和设计好的激活剂链（Act）组成，通过部分互补性组装。互补区域仅跨越前三个
结论
本工作通过引入基于锚定信号保留和按需释放的区室化工作流程，解决了传统微流控生物传感器在新兴污染物现场检测中的一个关键局限性——样品基质与信号放大的共存问题。在此设计中，激活剂在靶标识别和严格洗涤全过程中共价锚定在磁珠上，仅在基质去除后释放到隔离的检测腔室中。这种
CRediT作者贡献声明
Qi Lu：撰写–初稿、可视化、验证、方法论、调查研究、正式分析。Xingdong Dong：验证、方法论、调查研究、正式分析。Wenjing Kang：验证、调查研究。Zhen Liu：方法论、基金获取。Limin Yang：撰写–审阅与编辑、可视化、监督、方法论、基金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所报告工作的情况。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金委员会（编号：32572676和 82272110）以及山东省自然科学基金（编号：ZR2025MS1226）的资助。
Lu Qi|Dong Xingdong|Kang Wenjing|Liu Zhen|Yang Limin
