用于建立牛乳铁蛋白测量计量溯源性的纯度认证参考物质开发

《Microchemical Journal》：Development of a purity certified reference material for establishment of metrological traceability in bovine lactoferrin measurement

　　

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  研制了一种新的牛乳铁蛋白一级有证标准物质GBW10333。
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  采用质量平衡法和氨基酸同位素稀释液相色谱-串联质谱法（AA-ID-LC-MS/MS）赋予国际单位制（SI）可溯源的纯度值。
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  研究了均匀性检验、稳定性监测和不确定度评定。
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  牛乳铁蛋白有证标准物质的不确定度处于显著较低水平（3.3%）。

引言

近几十年来，牛奶及乳制品中生物活性蛋白的营养和健康促进功能日益受到重视，推动了这些蛋白在功能食品和专用营养配方中的广泛应用[1]，[2]，[3]。然而，准确、可靠地定量这类活性成分面临着巨大的分析挑战，主要源于乳制品基质的复杂性、生物活性蛋白结构的内在异质性，以及这些蛋白在加工过程中易发生变性或降解的特性[4]。在此背景下，计量溯源性和测量可比性成为合规监管和工业质量控制的关键前提。有证标准物质（CRMs）作为具有明确表征纯度且已证实均匀性和稳定性的既定测量标准，为方法验证、仪器校准以及为常规分析结果赋予可溯源值提供了不可或缺的基础[5]。有机化学有证标准物质作为测量系统的一级校准物，高纯度、低不确定度是其基本要求。值得注意的是，针对关键乳蛋白的商业化有证标准物质正日益可得。例如，α-乳白蛋白有证标准物质现已常规用作婴儿配方食品检测中LC-MS/MS应用的校准物，全奶粉参考物质则被广泛用于元素和营养成分测定的方法验证[5]。这些进展凸显了CRMs在确保乳制品分析准确性和可比性方面所发挥的核心作用。

在牛奶中众多生物活性蛋白中，牛乳铁蛋白（bLF）尤其受到科学界和产业界的关注[1]。作为一种属于转铁蛋白家族的80 kDa铁结合糖蛋白，bLF展现出显著的多种生物活性，包括抗菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤和益生元功能，使其成为生物医学和食品应用中最具价值的蛋白代表之一[1]，[6]，[7]。在食品工业中，由于bLF对免疫系统发育和肠道健康具有积极影响，它已被广泛应用于婴儿配方食品、功能食品、膳食补充剂和发酵乳制品中[1]，[2]。此外，作为营养强化剂的用途日益获得全球各国监管机构的认可[8]。

建立可靠的蛋白有证标准物质一直是分析生物化学和食品分析领域的长期优先事项。在过去二十年中，在临床诊断、生物制药质量控制和食品安全检测对计量溯源性需求不断增长的推动下，蛋白有证标准物质的研发取得了重大进展。已成功开发出用于方法验证和校准的关键蛋白分析物CRMs，包括人C肽[9]、淀粉样蛋白β[10]、胰岛素[11]，[12]、胰岛素样生长因子-1[13]、利钠肽[14]、Tau蛋白[15]、血管紧张素I[16]和生长激素[17]。在食品分析领域，用于致敏蛋白（如牛奶蛋白过敏原）[18]和营养蛋白（如β-乳球蛋白）[19]的CRMs日益可得，成为基于LC-MS/MS定量方法的关键校准物。尽管如此，重大挑战依然存在，尤其是针对结构复杂或存在翻译后修饰的蛋白。蛋白功能不仅取决于氨基酸序列，还取决于高级结构和糖基化、磷酸化等翻译后修饰，这使得纯度评估和赋值更加复杂[20]。对于许多生物活性食品蛋白而言，缺乏合适的CRMs持续阻碍实验室间可比性和合规监管[7]。新兴分析技术，包括基于标志肽的同位素稀释质谱法和先进的核磁共振技术，正越来越多地被应用于应对这些挑战，为准确的蛋白定量和纯度认证提供新途径[21]。

随着bLF市场需求不断扩张（主要用于婴儿配方食品、膳食补充剂和功能食品配方）[1]，确保bLF准确测量的重大挑战也随之凸显。一个根本性障碍是其含量在两大天然来源（初乳和成熟乳）中均微乎其微[1]，这就要求采用具有极高灵敏度和特异性的分析方法。此外，在加工食品基质中定量测定bLF的复杂性源于活性蛋白在热加工条件下固有的不稳定性，以及可能干扰检测信号的基质组分的干扰效应[4]。准确、特异、可比且SI可溯源的方法对于获得可靠结果至关重要。bLF纯度评估的若干方法已被探索。经过数年的专门研究，我们的团队在开发稳健可靠的bLF定量方法方面取得了显著进展。Yan等[21]利用质量平衡法和基于氨基酸的同位素稀释质谱法（IDMS）实现了bLF的SI可溯源纯度评估，两种独立策略之间取得了良好的一致性。质量平衡（MB）法通过从1中减去所有检测到的杂质组分间接确定纯度，而氨基酸IDMS（AA-IDMS）法则通过酸水解后经氨基酸分析直接量化蛋白从而直接确定纯度。由于这两种方法依赖不同的测量原理和不同的溯源路径，它们的吻合为有证值提供了强有力的交叉验证并降低了方法特异性偏差的风险，这对于牛乳铁蛋白这样的结构复杂糖蛋白尤为重要。有证值通过校准仪器溯源到SI（质量平衡法），并通过氨基酸纯度CRMs溯源到SI（AA-IDMS法）。这一双方法策略辅以完整的文档记录的不确定度预算，为乳制品中牛乳铁蛋白的准确可测量提供了可靠的计量基础。最近，一种基于标志肽的ID-LC-MS/MS方法用于bLF纯度赋值，所得结果与以往方法一致[4]。针对这些分析需求，中国近期发布了国家食品安全标准GB 5009.299–2024《食品中乳铁蛋白的测定》，规定了测定食品中乳铁蛋白（LF）的高效液相色谱（HPLC）方法，覆盖巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、调制乳粉和乳基婴儿配方食品等基质（GB 5009.299–2024）。然而，该标准的实施关键取决于有证标准物质的可用性。尽管α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等多种乳蛋白以及全奶粉的CRMs现已可得，但牛乳铁蛋白等复杂糖蛋白的SI可溯源一级纯度CRM仍然缺乏。具有明确定义的SI可溯源纯度值和完整文档记录不确定度预算的bLF CRM，可以为标准方法所得测量的准确性和可比性提供必要的支撑。因此，迫切需求研发bLF CRMs，为市场监管提供有效的质量控制工具，解决相关产品中LF含量标注错误或模糊等问题，确保消费者市场秩序井然。此外，这些CRMs将有助于保证乳制品中LF的安全生产和使用，从而提升食品安全并促进行业健康发展。

本研究由中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所研发的bLF纯度有证标准物质GBW10333，代表该领域的重大突破。本研究对比筛选了高纯度bLF原料，并采用两种主要方法测定纯度：质量平衡法和基于水解的氨基酸同位素稀释质谱法。开展了均匀性和稳定性评估，并系统评定了由表征、均匀性和稳定性引入的不确定度。结果表明，该bLF CRM表现出优异的均匀性，在?20 °C条件下19个月内以及50 °C条件下14天内保持稳定的可靠值，且两种表征方法之间表现出良好的一致性，证实了其准确性和可靠性。这一成就不仅填补了国内和国际标准物质可获得性方面的关键空白，也为乳铁蛋白纯度评估奠定了坚实的计量基础，使整个乳制品行业供应链从原料采购到终端产品质量控制能够实现可溯源、可比的测量。本研究旨在描述该bLF纯度有证标准物质的研发、表征和赋值过程，重点阐述确保其作为复杂食品基质中LF定量一级校准标准适用性的计量溯源策略和不确定度评定。

节选片段

材料与仪器

bLF原料来源于新西兰Synlait Milk有限公司。经SDS-PAGE和HPLC-UV对比筛选后确认，其纯度高于其他商业样品。LC-MS/MS分析采用配备电喷雾电离源的三重四极杆液相色谱/质谱联用仪完成。使用了ThermoMixer热混仪（Eppendorf ThermoMixer）。称量在梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）XP6超微量天平（可读性为百万分之一克）上进行。KINETEX C18色谱柱。

CRM候选物的制备

经主成分分析初步鉴定和鉴别的牛乳铁蛋白纯度参考物质，在洁净干燥的分样环境中平衡后，分装至5 mL棕色玻璃瓶中。每个单位含该物质200 mg，并用螺旋盖密封。共制备200个单位，候选参考物质整批真空密封于塑料袋中，存放于?20 °C。

均匀性和稳定性评估

根据ISO指南35，15个单位

结论

成功研制出一种新的牛乳铁蛋白纯度CRM（GBW10333）。其有证纯度值为（95.6 ± 3.3）%（k = 2）。该物质在?20 °C下19个月及50 °C下14天内表现出优异的均匀性和稳定性。该值采用两种独立、SI可溯源的方法（MB和AA-IDMS）赋值，并建立了全面的不确定度预算。该CRM将成为验证分析方法（如GB5009.299–2024中的方法）的关键工具，

CRediT作者贡献声明

Yan Jingjing（严静静）：写作—初稿撰写、方法学。Yang Mengrui（杨梦蕊）：写作—审阅与编辑、项目管理。Li Ling（李玲）：调查研究、正式分析。Zhou Jian（周剑）：验证。Li Fukai（李富开）：验证、正式分析。Li Kai（李凯）：验证。Li Liang（李亮）：调查研究。Wang Min（王敏）：调查研究。

利益冲突声明

作者声明不存在可能被认为影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢国家重点研发计划（2024YFF1105804）和农业科技创新计划（CAAS-ASTIP-2025-IQSTAP）提供的资金支持。

Yan Jingjing|Yang Mengrui|Li Ling|Zhou Jian|Li Fukai|Li Kai|Li Liang|Wang Min